第八章动物基因组学基础.ppt

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1、1,第八章动物基因组学基础,第一节动物遗传标记 一 遗传标记的概念及其发展（一）遗传标记的概念 遗传标记是指能够用以区别生物个体或群体及其特定基因型、并能稳定遗传的物质标志。遗传标记是一些等位基因或遗传物质，能在生物体上以各种形式表现出各种变异。遗传标记的概念经历了从宏观到微观、从外部到内部、从蛋白质到DNA的发展过程。,2,（二）遗传标记概念的发展 形态学标记 能用肉眼观察和识别的外部性状。例如，动物的毛色、角形、耳型、体型、外貌等。此法简单直观，但标记数目少、多态性低、易受环境影响。细胞遗传标记 主要是指染色体核型（染色体的数目、大小、随体、着丝粒位置、核仁组织区等）、带型和数量的变异。此

2、法能反映出染色体结构和数目的多态性，但由于这些变异往往带来有害的表型效应，生物难以忍受。,3,免疫遗传标记 以动物的免疫学特征为标记，主要是红细胞抗原多态性和白细胞抗原多态性。红细胞抗原多态性血型，以细胞表面的抗原而定 白细胞抗原多态性主要组织兼容性复合体（MHC），以白细胞表面的抗原而定。生化遗传标记（蛋白质多态性标记）同一种动物中，具有相同功能的蛋白质存在两种以上的变异体，有些可以用电泳方法区分其中的差异。,4,分子遗传标记 分子遗传标记是以DNA多态性为基础的遗传标记，又称DNA分子标记或多态性DNA标记。自20世纪70年代以来，随着分子生物学的发展，相继建立了多种分子遗传标记检测技术，

3、例如，RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等。分子遗传标记的特点：遗传多态性高；检测方法简单快捷；遗传共显性，能分离出等位基因的三种基因型。,5,二、分子遗传标记（一）限制性片段长度多态性（restiction fragment length polymorphism,RFLP）RFLP RFLP是1980年建立的第一代分子遗传标记。原理：用限制性内切酶切割不同个体的DNA时，如果存在酶切位点的变化，就会产生长度不同的DNA片段，电泳后用克隆探针检测时，就会出现泳动行为的改变。基本过程：取得DNA样本酶切电泳转移至硝酸纤维膜上DNA探针杂交放射自显影,6,图7-1 Southern杂

4、交过程,7,图7-2 RFLP检测,8,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）PCR是1985年建立的一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。原理：在反应温度为9095时，DNA变性成为单链；反应温度降至4565时，两种引物与两条单链DNA退火而配对结合；反应温度升至72左右时，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以单链DNA为模板逐步延伸成新的单链。“变性退火延伸”这一循环完成后，DNA复制了一次，由一个DNA分子成为两个DNA分子。,9,图7-3 DNA扩增原理,10,PCRRFLP 如果已知多态性位点周围的DNA序列，则可用PCR快速而简单地进行RF

5、LP分析。首先根据多态位点两侧序列设计和合成引物；以基因组DNA为模板进行PCR扩增；用相应的内切酶进行消化；再进行电泳，分析PCR区带判断多态性。,11,图7-4 PCRRFLP,12,（二）串联重复序列标记（tandem repeated sequence,TRS）真核基因组序列 单一序列 短片段重复序列（正向重复、反向重复、回文序列）长片段重复序列（轻度重复、中度重复、高度重复）,13,高度重复序列 卫星DNA（satellite DNA）序列中G-C含量约30%，远低于基因组中主体DNA（G-C含量约42%）。将DNA切成片段进行氯化铯密度梯度离心时，由于富含A-T浮力密度小，形成一条

6、窄带在主体DNA外面，故称卫星DNA。小卫星DNA（minisatellite DNA）微卫星DNA（microsatellite DNA）,14,图7-6 卫星DNA,15,小卫星标记 小卫星DNA是一种可变数量的串联重复（varible number of tandem repeats,VNTR），在不同个体和基因组的不同位点上数目都不同。用内切酶把总DNA切成不同长度的片段（VNTR上没有酶切位点），再以VNTR中的特殊序列为探针进行Southern杂交，由于不同个体的这种串联重复的数目及位置不同，所以VNTR的Southern杂交谱带具有高度的个体特异性，故又称其为DNA指纹（DNA

7、fingerprints）。,16,微卫星标记 微卫星DNA又称短串联重复序列（STR），重复单位的核心序列为26 bp。以微卫星DNA两侧特异性序列设计探针，用PCR技术扩增微卫星片段，扩增产物经电泳分离，不同个体因核心序列重复次数不同而产生DNA多态性。,17,真核生物基因组序列,18,一个家系的微卫星PCR检测结果,19,（三）单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphism,SNP）SNP与RFLP、STR等标记不同之处在于不以“长度”差别为检测手段，而是直接以序列的变异作为标记。基因组DNA某一特定的核苷酸位置上，可能发生单个碱基的变化，如转换、颠换等

8、，使得群体中基因组的某些位点上存在差异。SNP就是指基因组内特定的核苷酸位置上存在两种以上不同的核苷酸，其中最少一种在群体中的出现频率不少于1%（低于1%则视为突变）。,20,SNP是出现频率最高的标记，人类基因组中平均每1000 bp中就有1个SNP，总数可达300万个。位于基因表达序列内的SNP可能会影响蛋白质的结构和表达水平，对分析基因与性状的关系有重要意义。SNP是单碱基突变，任何用于单碱基突变的技术都可用于SNP检测，如RFLP、DNA序列分析、单链构象多态性（SSCP）等。最先进的是微数列矩阵DNA芯片（DNA chip）技术。,21,三、分子遗传标记的应用 个体及亲缘关系的鉴定

9、DNA指纹 遗传资源的评估、监测、保护和利用 基因定位和遗传图谱的构建 标记辅助选择,22,第二节基因组作图 一、基本概念 基因组作图主要分两个范畴：遗传作图（genetics mapping）和物理作图（physical mapping）。作图需要界标（landmark）或遗传标记（genetics marker）。常用的遗传标记（血型、蛋白质多态型、等位基因、特定的DNA序列等）在早期构建遗传图时常用作制图的界标。现在主要采用以下的界标：限制性片段长度多态性（RFLP）微卫星DNA多态性界标 单核苷酸多态性（SNP）界标 非多态的短单一序列作为界标,23,二、遗传图（一）基本概念 应用遗传

10、学技术构建能显示基因以及其它序列特征在基因组上位置的图。方法是以多态的遗传标记作为界标，计算细胞减数分裂过程中遗传标记之间发生重组的频率，来确定两个遗传标记在染色体上的相对位置。遗传标记之间的相对距离即图距以厘摩（cM，厘摩尔根，centi-Morgan）为单位。当两个遗传标记之间的重组值为1%时，图距即为1cM。,24,经典遗传图的作图最常用的是三点测交法。现代遗传图的概念是于1980年提出的，就是将单纯的表型多态性界标改变为以DNA序列的多态作为作图界标。各种遗传界标可在国际互联网上可以查阅（http:/www.gdb.org）。当用DNA序列多态作为界标的遗传图时，一但确定该DNA界标与

11、某一基因的具体位置，便可分离克隆这个基因。人类第一张以RFLP为界标的遗传图发表于1987年。,25,（二）遗传图的局限性 分辨率有限 高等真核生物子代数量有限，只有少数的减数分裂事件可供研究，连锁分析的分辨率受很大限制 人类基因组测序要求每100kb有一个标记，1996年发表的人类遗传图达到每0.6Mb一个标记（1Mb=1000kb）精确度较低 假设交换是随机发生的，但由于交换热点的存在使某一区段的交换频率远高于其它区段，无法绘制精确的遗传图。,26,三、物理图（一）基本概念 应用分子生物学技术来直接分析DNA分子，从而构建能显示包括基因在内的序列特征的位置图。以特定的DNA序列为界标直接排

12、列在基因组DNA分子上，这些特定的DNA序列可以是多态的（如RFLP），但主要是非多态的（如STS、STR、EST）和特定的基因序列等。物理图中界标之间的距离单位依作图方法而定，辐射育种作图单位为厘镭（cR），限制性作图单位元以物理长度，即碱基对数目（bp、kb）来表示。,27,（二）作图的基本方法 1限制性作图将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置上。限制性内切酶有型、型、型，型、型酶位点特殊性不强，型专一性很强。6 bp识别序列的限制性内切酶适用于50 kb以下的DNA分子作图。限制性作图方法是：比较一个DNA分子被两种酶切割产生的两套片段。,28,图7-16 限制性内切酶,29,3序

13、列标记位点（sequence tagged site,STS）作图通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中。是目前用于构建最为详尽的大基因组物理图的主流技术。STS作图原理 STS是一段短的DNA序列（100500）bp，每个基因组只有一个拷贝。当两个片段含有同一STS时，可确认这两个片段重叠。两个不同的STS出现在同一片段的机会取决于它们在基因组中的位置，彼此接近，同时出现在同一片段的机会就大，反之则小。两个标记间的图距根据分离频率来计算。,30,STS 的种类 表达序列标记（expressed sequence tag,EST），是从cDNA克隆中获得的短序列。EST

14、是获得基因序列的简捷方法。简单序列长度多态性（SSLP，小卫星和微卫星）。随机基因组序列，从克隆的基因组DNA中随机测序获得。,31,第三节 基因定位方法 动物有几十条染色体，有几万个基因，平均每条染色体有上千个基因。确定基因在哪一条染色体的哪一个座位上就是基因定位。将定位的基因标注在染色体上就可得到基因图（gene map）基因定位与基因组作图和基因克隆关系密切：基因定位后可以作为一个界标；确定基因的位置后就可按图去分离克隆基因 不同生物的基因定位方法不完全相同。基因定位的方法随着遗传学的发展而进步。,32,一、质量性状的基因定位 质量性状从表型上可以明显区分为不同类型的性状。（一）家系分析

15、定位法 性连锁分析是最常用的方法。哺乳动物中只出现在雄性的性状，控制该性状的基因在Y染色体上。性状出现隔代交叉遗传、且雄性出现比例高于雌性，则控制该性状的基因在Y染色体上。（二）遗传重组值定位法 摩尔根提出的方法，根据基因间的重组值与遗传距离成正比的原理，采用两点测交和三点测交的方法进行基因定位。,33,（三）体细胞杂交定位法 不同物种细胞融合后，杂种细胞会出现排除某一亲本染色体的现象，在人鼠杂种细胞常专一性地排除人的染色体。可以制备含一条（或少数几条）人染色体的杂种细胞。定位测验法 鉴别杂种细胞中保留了哪些人染色体，测定杂种细胞产生了哪些基因产物，经分析可将基因定位在哪一条染色体上。,34,

16、（四）原位杂交定位 将待定位基因的特定DNA序列或该基因转录的RNA作为探针，在标记了放射性同位素或非放射性化学物质后，与变性后的染色体DNA杂交，该探针就会同染色体DNA与其互补的序列结合成为双链，通过放射自显影或显色技术，就可确定探针（即待定基因）在染色体上的位置。,35,二、数量性状的基因定位 数量性状由微效多基因控制的呈连续变异的性状。由于每个基因效应值都较小，无法阐明单个基因的行为和效应，只能当作一个整体来分析。同时，对控制数量性状的基因数目不能准确估计，不能用提供基因的实际位置和功能上的信息。随着分子数量遗传学的发展，极大地深化了数量遗传学的理伦，提供了在DNA水平研究数量性状的先

17、进技术。,36,主效基因对某一数量性状具有很大的效应的等位基因。由于自发或诱发突变引起明显的形态学上的变异。如猪的氟烷基因、牛的双肌基因等。数量性状基因位点（QTL）具有相同或相关功能的基因往往分布在某一染色体区域内，从而形成基因群。控制同一性状的微效基因可能存在于有限的几个基因群内，而一基因群占据染色体的一定区域，称作数量性状基因座（quantitative trait locus,QTL）,37,一些QTL可以对数量性状有较大的影响（对数量性状的影响超过表型值方差的5%），因而具有选择价值 一个数量性状往往受多个QTL的影响，这些QTL分布在基因组的不同位置上。利用特定的遗传标记可以确定影

18、响某一性状的QTL在染色体上的数目、位置及其遗传效应，这就是QTL作图或称QTL定位 QTL作图原理：利用特定遗传分离群体中的遗传标记及相应的数量性状观察值，分析遗传标记与性状之间的连锁关系。如果证明遗传标记与性状连锁，则可认定标记附近存在一个或几个QTL,38,QTL作图步骤：构建作图群体该群体待测的数量性状存在广泛变异，如F2群体 选用合适的遗传标记须具备4个特征：数量丰富，多态性好，中性，共显性。如RFLP、AFLP、RAPD、VNTR、SSR等 测定标记的基因型，制作标记的遗传图谱 应含有P1，P2和杂合型三种带型（即三种基因型）。测量数量性状测定遗传标记时，测定其数量性状值 统计分析

19、单标记分析、双分子标记分析、多分子标记分析。,39,定位QTL主要有两种方法：基因组扫描利用遗传上差异较大的品种进行杂交，跟踪性状和染色体上的标记在多世代家系中的分离情况。候选基因法不需特定品种的杂交，只要发现一个候选基因位点上存在多态性，便可直接在商业品系中研究该多态性与目标性状之间的相关性。,40,QTL的性质 QTL可能是一个基因，也可能是几个基因；数量性状受为数不多、效应不等的几个QTL影响。少数位点对性状变异贡献很大 由于不同群体的遗传背景不同，根据不同群体确定的QTL会有差异 统计分析确定的QTL的位置并非物理上的位置,41,QTL的应用 由QTL得到的遗传图可进一步换算成物理图，

20、对QTL进行克隆和序列分析，研究控制数量性状的基因结构和功能。在育种上进行标记辅助选择，利用标记与性状的连锁提早进行识别和选择。利用标记与性状的连锁分析，可以提供与杂种优势有关的信息，鉴定与优势有关的位点，确定亲本在QTL上的差异，可能预测杂种优势。,42,第四节 动物基因组学 一、基因组研究的新学科 基因组学（genomics）研究基因组结构与功能的分支学科，又分为结构基因组学和功能基因组学。转录物组学（transcriptomics）研究某一时刻某一细胞里基因组产生的全部转录物的种类、结构和功能。蛋白质组学（proteomics）研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的学科。表型组学（ph

21、enomics）研究生物体整个表型形成的机制。,43,二、人类基因组计划 美国于1990年由能源部和国立卫生研究院起动了预算耗时15年、经费30亿美元的人类基因组计划 2001年2月15日，由中、美、英、法、德、日等6国科学家组成的“人类基因组测序国际协作组”，在自然杂志上发表了关于人类基因组框架图的数据；次日，美国Celera Genomics公司的也公布了人类基因组框架图的数据。有关人类遗传本性的“生命之书”的诞生，是生命科学发展史上的一个重要里程碑。,44,人类基因组计划的主要内容 基因组作图绘制遗传图，物理图。测序测定全基因组DNA分子的核苷酸序列，绘制序列图。基因识别识别出基因序列，

22、设法克隆基因，研究基因功能。模式生物研究大肠杆菌、酵母菌、线虫、果蝇、小鼠等。发展生物信息学和计算生物学 基因组对伦理、法律和社会产生的影响,45,三、动物基因组计划及其应用前景 先后开展猪、牛、绵羊、鸡等动物的基因组研究，目标大致相同。猪基因组计划的目标 构建遗传图复盖基因组90%以上，标记间距20cM左右的遗传图；构建标记位点每条染色体臂至少一个远端和近端的标记；开发猪染色体激光流动分型技术；开发快速测定多态分子的PCR技术；开发和评估用于分析QTL作图试验数据的统计方法,46,应用前景 基因诊断检测基因型，区分显性纯合体和带缺陷隐性基因的杂合体，从而淘汰隐性基因。标记辅助选择和标记辅助导入基因 标记辅助选择是利用与影响性状紧密连锁的遗传标记来进行选择。标记辅助导入基因是指检测杂种后代的基因型，选留带有所需基因的杂种个体作种用，再与亲本回交，多次重复可将基因导入。研究地方品种种质特性,