植物生化制药第五章核酸类药物.ppt

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1、第五章 核酸类药物,第一节 概述,核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,98%分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体。,主要分布于细胞质（90%），剩余10%位于细胞核。,(deoxyribonucleic acid,DNA),(ribonucleic acid,RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。,参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。,核酸,碱基,戊糖,核苷,磷酸,核苷酸,核酸类药物是具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷以及碱基的统称。除了天然存在的碱基、核苷、核苷酸外，它们

2、的类似物、衍生物或这些类似物、衍生物的聚合物也属于核酸药物。,一、RNA的制备（一）材料的选择与预处理制备RNA的材料要选择含核酸量丰富的组织。RNA的含量和细胞的活跃程度有关，在蛋白质合成旺盛的细胞中，其核酸的含量也相应地较高。,第二节 核酸类药物的一般制备方法,1.酸处理法 将经酸和有机溶剂处理后的残留物用1mol/L的过氯酸液于4下处理18 h，从中抽提出RNA，沉淀部分再用0.5mol/L的过氯酸液70 下处理20 min提取DNA。此法的缺点是有些材料的DNA在冷过氯酸抽提时被少量提取，从而使RNA部分中混有少量的DNA。2.碱处理法将残留物用1mol/L的NaOH溶液于37 处理过

3、夜，则RNA被碱解为碱溶性核苷酸，DNA不溶解。加入过氯酸或三氯乙酸使溶液酸化，至酸浓度为5%-10%,此时，RNA的分解产物溶解在上清液中，DNA等则被沉淀下来。此法的优点是RNA和DNA分开得较为彻底，缺点是RNA中还含有其他含磷化合物，如磷肽，磷酸肌醇等。,（二）提取与纯化,1.提取（1）乙醇沉淀法（2）去污剂处理法（3）酚法,2.纯化（1）密度梯度离心法（2）柱色谱法（3）凝胶电泳法,（三）含量测定,定磷法（1）核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；（2）制定定磷标准曲线；（3）测定回收率和样品总磷量。(NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4)2SO4 H3PO4+1

4、2H2MoO4 H3P(Mo3O10)4+12H2O H3P(Mo3O10)4 Mo2O3 MoO3（钼蓝）定糖法,Vit C,RNA中的戊核糖可在盐酸的水解作用下游离出来，进一步形成糠醛，然后与地衣酚反应，反应物程鲜绿色，在670nm有最大吸收峰。,二、DNA的制备,材料的选择与处理2.提取与纯化3.含量测定（1）定磷法 同RNA（2）定糖法 又称二苯胺法，在酸性溶液中，将DNA与二苯胺共热，形成蓝色化合物，该化合物在595nm有最大吸收。当DNA浓度在20-200ug/mL时，光吸收度与DNA浓度呈正比。,三、核苷酸、核苷及碱基的制备,（一）制备方法1.直接提取法2.水解法（1）酶水解法（

5、2）碱水解法（3）酸水解法3.化学合成法4.酶合成法5.微生物发酵法,光合磷酸化法制备ATP的工艺流程,ATP的药理作用与临床应用,在生物体内，ATP广泛参与各种生化过程，除参与核酸形成外，主要起着供应能量和磷酸基团的作用。ATP除了作为危重病人抢救的辅助药物外，还可对慢性肝炎、肝硬化、肾炎、心肌炎、冠状动脉硬化、进行性肌肉萎缩、再生障碍性贫血、脑血管意外后遗症、中心性血管痉挛性视网膜脉络膜炎、风湿性关节炎、耳聋、耳鸣等有一定疗效。,第五章 酶类药物,第一节 概述,一、酶类药物发展简史,酶类药物是直接用各种剂型的酶以改变体内酶活力，或改变体内某性质生物活性物质和代谢产物的数量等，从而达到治疗某

6、些疾病的目的。1926年，Sumner将尿素酶结晶是药用酶工业化的起点。1952年，Innerfield首次将结晶的胰蛋白酶用于治疗血栓性静脉炎，真正揭开了酶在医疗应用的序幕。20世纪60年代后期，逐渐发展到从微生物发酵液中获得大量的酶。70年代后，开始利用人的某些组织细胞培养技术和基因工程手段来获取有关的酶，使酶类药物的应用得到了迅速发展。,对酶类药物的要求,1.药用酶应在生理环境（pH中性）下具有最高活力和稳定性。2.对其作用的底物具有较高的亲和力。3.在血清中半衰期较长。4.要求纯度高，特别是对注射用的酶类药物纯度要求更高。5.酶应免疫源性较低或无免疫源性。,二、酶的分子组成及分类,1.

7、酶分子的组成单体酶寡聚酶多酶复合体,2.酶的分类,三、酶类药物的临床应用,1.消化酶类2.抗炎、黏痰溶解酶3.与纤维蛋白溶解作用有关的酶类4.抗肿瘤的酶类5.其它生理活性酶6.复合酶,表6-2 酶类药物一览表,第二节 酶类药物的一般制备方法,酶制备过程的特点：一是某种酶在生物体内含量甚少，且有分布部位特异性。二是酶可以通过测定其活力加以跟踪。酶制备一般包括四个步骤：酶的原材料的选择与处理；酶的提取；酶的纯化；酶活力的测定和纯度检测。,一、酶的原材料选择与预处理,（一）原材料的选择（1）了解目的酶在生物材料中的分布特点，选择适宜的生物材料。（2）考虑生物在不同发育阶段及营养状况时，酶含量的差别及

8、杂质干扰的情况。（3）原料来源是否丰富，原料易得，原料产地较近。（4）提取步骤是否简便易行。用植物组织作原料，要择时采集并就地去除不用部分，将有用部分保鲜处理。,（二）原材料的预处理,1.机械法2.反复冻融法3.超声波法4.酶解法5.丙酮粉法,二、酶的提取1.水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取，经过预处理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒，丙酮粉都可用水溶液抽提。水溶液的pH选择对抽提具有影响，应考虑的因素有：酶的稳定性 酶的溶解性 酶与其他物质结合的性质 选择pH的总原则是，在酶稳定的pH范围内，选择偏离等电点的适当的pH。,2.有机溶剂法 某些结合酶，由于和脂质结合牢固，需用有机溶剂除去脂

9、质，且不能使酶变性。常用有机溶剂是丁醇。丁醇性质：亲脂性强、兼具亲水性、在脂与水分子间能起表面活性剂的桥梁作用。丁醇提取方法：均相法和两相法3.表面活性剂法,三、酶的纯化,不同的酶，因性质不同，其纯化工艺可能有很大不同。评价一个纯化工艺好坏，主要看两个指标：酶比活和总活力回收率。（一）杂质的除去1.调pH和加热沉淀法（核糖核酸酶，溶菌酶的提取）2.蛋白质表面变性法（CAT用氯仿提取）3.选择性变性法（细胞色素C可用三氯醋酸提取）4.降解或沉淀核苷酸法5.利用结合底物保护法除去杂蛋白（D-甲基苯甲酸为D-氨基酸氧化酶的保护剂）,（二）脱盐和浓缩1.脱盐（1）透析（2）凝胶过滤2.浓缩（1）蒸发（

10、2）超滤法（3）凝胶吸水法（4）冷冻干燥法,（三）酶的结晶,1.盐析法2.有机溶剂法3.透析平衡法4.等电点法,四、酶活力的测定与纯度检验,1.活力测定 无论在酶的抽提纯化过程中或是对酶的性质进行研究过程中为了了解所选择方法是否适宜，几乎每一步骤前后都应进行酶的活力测定，做出总活力和比活力的比较。2.纯度检测 在酶的分离提纯中，总活力用于计算某一抽提或纯化步骤后酶的回收率（Y），而比活力则用于计算某一纯化步骤的效果，即纯度的提高（E），其关系如下：Y=某步骤后的总活力/某步骤前的总活力 E=某步骤后的比活力/某步骤前的比活力,五、菠萝蛋白酶,是从菠萝汁或加工菠萝削下的废皮中提取的一种蛋白水解酶

11、，粗菠萝水解酶是各种成分的混合物，除蛋白水解酶系外，还含有磷酸酯酶、过氧化物酶、纤维素酶、其它糖苷酶及非蛋白物质。实验证明，菠萝蛋白酶具有消炎抗水肿作用，作用特点是能选择性水解纤维蛋白，对与凝血有关的纤维蛋白原仅有微弱的作用，不影响正常血液的凝固。能分解肌纤维，可单独或与胰蛋白酶制成合剂使用，消除各种单纯性炎症、水肿、血肿，促进抗生素和化疗药物的渗透和扩散。临床适用于治疗支气管哮喘、急性肺炎、产后乳房充血、乳腺炎、产后血栓静脉炎、视网膜炎等。试用于同抗生素配伍治疗关节炎、关节周围炎、蜂窝组织炎和小腿溃疡等。,（一）化学性质和组成白色至浅棕黄色无定形粉末。略溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白

12、光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚，为一种巯基酶。半胱氨酸能激活酶的活性，但受重金属抑制。最适pH7.0，相对分子量33000。主要作用原理：使多肽类水解为低分子量的肽类。,（二）生产工艺（白陶土吸附法）,（吸附）白陶土10,菠萝蛋白酶成品,湿菠萝蛋白酶精制品,澄清液,粗制品,（沉淀）HCl pH4,（溶解）自来水，NaOH,洗脱液,（盐析、抽滤）HCl，（NH4）2SO4pH=4.55,吸附物,（洗脱）Na2CO3或NaOH（NH4）2SO4pH=6.57,压出液,菠萝皮,（压榨）苯甲酸钠,（干燥、粉碎）,pH77.5,（三）检验方法,1.性状 富有菠萝香气，浅黄色或浅棕黄色粉末。2.蛋白酶水解活力

13、测定（1）原理 菠萝蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并沉淀除去未水解的蛋白，滤液对紫外光有吸收，用紫外分光光度计法测定，根据吸光度计算酶活力。（2）酶活力单位定义 在测定条件下 pH7.0，（37+0.2），每分钟水解酪蛋白释放出的三氯乙酸可溶物在275nm的吸光度与1g酪氨酸的吸光度相当时，所需酶量为1U。,（3）测定步骤 适当稀释样品后，精密量取样品待测液1mL，置于具塞试管中，于，37预温10min，迅速加入37预温的酪蛋白溶液5mL，从开始加入起准确反应10min，加入三氯乙酸溶液5mL，混匀，保温10min后过滤。另量取1mL待测样品液于37

14、预温10min，精密加入三氯乙酸溶液5mL，准确反应10min，加入酪蛋白溶液5mL，摇匀，保温10min后过滤，滤液作为上述溶液的空白对照。用分光光度计在275nm的波长处测吸光度A。以水做空白对照，在275nm的波长处测定50g/mL酪氨酸吸光度A。,（四）菠萝蛋白酶在医药、保健品业的应用 1、抑制肿瘤细胞的生长 经相关临床研究观察表明，菠萝蛋白酶能抑制肿瘤细胞的生长。2、对心血管疾病的防治 菠萝蛋白酶作为蛋白水解酶对心血管疾病的防治是有益的。它能抑制血小板聚集引起的心脏病发作和中风,缓解心绞痛症状,缓和动脉收缩,加速纤维蛋白原的分解。3、用于烧伤脱痂 菠萝蛋白酶能选择性地除 皮,使新皮移

15、植得以尽早进行。动物实验证明,菠萝蛋白酶对邻近的正常皮肤无不良影响。局部使用抗生素不影响菠萝蛋白酶的效果。,4、消炎作用 菠萝蛋白酶在各种组织中能有效地治疗炎症和水肿(包括血栓静脉炎、骨骼肌损伤、血肿、口腔炎、糖尿病人溃疡及运动损伤)，菠萝蛋白酶具有激活炎症反应的潜力。菠萝蛋白酶还可治疗腹泻。5、增进药物吸收 将菠萝蛋白酶与各种抗生素(如四环素,阿莫西林等)联用,能提高其疗效。相关研究表明,它能促进抗生素在感染部位的传输,从而减少抗生素的用药量。据推断,对于抗癌药物,也有类似的作用。此外，菠萝蛋白酶能促进营养物质的吸收。,第七章 多糖类药物,第一节 糖类药物概述按照含有糖基数目的不同分为:单糖

16、：葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等。低聚糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖等。多糖：（糖类药物研究的最多是多糖类药物）多糖如有旋糖酐、甘露聚糖、香菇多糖、茯苓多糖等。还有一些糖类药物是糖的衍生物，如6-磷酸葡萄糖，1，6-二磷酸果糖，磷酸肌醇等。,多糖的药理作用,（1）调节免疫功能 主要表现为影响抗体活性，促进淋巴细胞增殖，激活或提高吞噬细胞的功能。增强机体的抗炎、抗氧化和抗衰老作用。（2）抗感染作用，多糖可以提高机体组织细胞对细菌，原虫，病毒和真菌感染的抵抗力。（3）促进细胞DNA，蛋白质的合成，促进细胞的增殖、生长。,（4）抗辐射损伤作用，抗射线的损伤，有抗氧化、防辐射作用。（5）抗肿瘤和抗凝血作

17、用，肝素是天然抗凝剂。（6）降血脂和抗动脉粥样硬化功能。硫酸软骨素、小分子肝素、壳聚糖等具有降血脂、降血胆固醇，抗动脉粥样硬化作用，用于防治冠心病和动脉硬化。,多糖,结合型,游离型,脂多糖：与脂类结合在一起,糖蛋白：与蛋白质结合在一起,多糖的相对分子量较大，有直链和支链两种，多可溶于水，水溶液具有一定的黏度，能被酸、碱和酶水解成单糖或低聚糖。,多糖根据来源不同可分为：(1)植物多糖：黄芪多糖，人参多糖。(2)动物多糖：肝素，透明质酸，硫酸软骨素等。(3)微生物多糖：香菇多糖，灵芝多糖。,第二节 糖类药物的一般制备技术,一、单糖、低聚糖及其衍生物的制备 用水或在中性条件下以50乙醇，也可以用82

18、乙醇，在7078下回流提取。溶剂用量一般为材料的10倍，需多次提取。植物材料磨碎经乙醚或石油醚脱脂，拌加碳酸钙，以50乙醇温浸，浸液合并，于4045减压浓缩至适当体积，用中性醋酸铅去杂蛋白及其他杂质，铅离子可通H2S除去，再浓缩至粘稠状。以甲醇或乙醇温浸，去不溶物如无机盐或残留蛋白质等。醇液经活性炭脱色、浓缩、冷却、滴加乙醚，或置于硫酸干燥器中旋转，析出结晶。单糖或小分子寡糖也可以在提取后，用吸附层析法或离子交换法进行纯化。,二、多糖的分离与纯化,多糖可来自动物、植物和微生物，植物体内含有水解多糖衍生物的酶，必须抑制或破坏酶的作用后，才能制取天然存在形式的多糖。提取多糖的材料必须新鲜或及时干燥

19、保存，避免受高温破坏因此，速冻冷藏是保存材料的有效方法。提取所用溶剂根据多糖的溶解性质而定。,（一）多糖的提取提取多糖时，一般先需进行脱脂，以便多糖释放。方法是将材料粉碎，用甲醇或11乙醇乙醚混合液，加热搅拌13小时，也可用石油醚脱脂。动物材料可用丙酮脱脂、脱水处理。,1、稀碱液提取 用于难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者。这一类多糖主要是不溶性胶类，如木聚精、半乳聚糖等。用冷水浸润材料后用0.5 molL NaOH提取，提取液用盐酸中和、浓缩后，加乙醇沉淀得多糖。如在稀碱中仍不易溶出者，可加入硼砂，对甘露聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸络合物的多糖，此法可得相当纯的物质。,2、温热水提取 易溶于温水

20、、难溶于冷水和乙醇者。材料用冷水浸过，用热水提取，必要时可加热至8090搅拌提取。提取液用正丁醇与氯仿混合液除去杂蛋白（或用三氯乙酸除杂蛋白），离心除去杂蛋白后的清液，透析后用乙醇沉淀得多糖。,3、粘多糖 因大部粘多糖与蛋白质结合于细胞中，因此需用酶解法或碱解法使糖-白质间的结合键断裂，促使多糖释放。（1）碱解法 多糖与蛋白质结合的糖肽键对碱不稳定，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。（2）酶解法 蛋白酶水解法已逐步取代碱提取法而成为提取多糖的最常用方法。鉴于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键，为除去长肽段，常与碱解法合用。常用的酶制剂有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶。,（二）多

21、糖的纯化1.乙醇沉淀法 乙醇沉淀法是制备粘多糖的最常用手段。乙醇的加入，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。向溶液中加入一定浓度的盐，如醋酸钠，醋酸钾、醋酸铵或氯化钠有助于使粘多糖从溶液中析出，盐的最终浓度5即足够。多次乙醇沉淀法脱盐，也可以用超滤法或分子筛法（SephadexG-10或G-15）进行多糖脱盐。沉淀物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空干燥即可得疏松粉末状产品。,2.分级沉淀法 不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的粘多糖。在Ca2+、Zn2+等二价金属离子的存在下，采用乙醇分级分离粘多糖可以获得最佳效果。,3.季胺盐

22、络合法 粘多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和十六烷基氯化砒啶（CPC）等能形成季胺盐络合物。络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大时，络合物可以解离、溶解、释放。,（三）多糖药物的鉴定检测方法,1.定量测定（1）苯酚-硫酸法（2）蒽酮-硫酸法（3）氨基己糖的比色测定 先在盐酸溶液中将氨基己糖经碱性乙酰化后，再与对二甲基苯甲酸发生呈色反应，从而进行定量测定。,2.鉴别,（1）测定糖基组成（2）高压电泳法鉴定多糖均一性（3）超离心法鉴定多糖均一性（4）凝胶柱色谱法鉴定多糖均一性（5）分子量测定,第三节 香菇多糖,一、结构与性质为白色粉末状固体，对光和热稳定。溶

23、于水和0.5mol/L的NaOH，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。,二、生产工艺,1.常规提取法 鲜香菇 捣碎 浸渍 过滤 浓缩 乙醇沉淀 乙醇、乙醚洗涤 干燥 成品2.复合酶提取法3.深层培养提取法,三、质量检测,1.试剂浓硫酸：分析纯，95.5%苯酚：80g苯酚加20g水使之溶解，可置冰箱中长期贮存。6%苯酚：临用前用80%苯酚配制。标准葡聚糖、葡萄糖或标准香菇多糖。,2.方法（1）制作标准曲线 准确称取标准葡萄糖20mg溶于500mL容量瓶中加水至刻度，分别吸取0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL及，1.8mL各用水补充至2.0mL，然后加

24、入6%苯酚1.0mL以及浓硫酸5.0mL，静止10min，摇匀，室温放置20min。在490nm处测光密度，以2.0mL水按同样显色操作作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。（2）样品含量测定。吸取1mL样品，按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线计算多糖含量。,第八章 脂 类 药 物,第一节 概 述,脂类物质是广泛存在于生物体中的脂肪及类似脂肪的、能够被有机溶剂提取出来的化合物，由于分子中的碳氢比例都较高，能够溶解在乙醚、氯仿、苯等有机溶剂中，不溶于水。脂类化合物的这种性质，称之为脂溶性，利用这一性质，将脂类物质用有机溶剂从生物体中提取出来。实际上，脂类药物往往是互溶在一

25、起的，依据脂溶性这一共同特点归为一大类成为脂类，而不是一个准确的化学名词。,脂类药物是具有重要生理生化、药理药效作用的脂类物质。大体可分为以下几类：胆汁酸类，如胆酸、脱氧胆酸。不饱和脂肪酸类，如花生四烯酸、亚麻油酸等；磷脂类，如：卵磷脂、脑磷脂；固醇类，如：胆固醇、麦角固醇；色素类，如：胆红素、血红素等；其他，如鲨烯等。,一、脂类药物的制备方法1.直接抽提法2.水解法3.化学合成4.生物合成法,二、脂类药物的分离,1.溶解度法2.吸附分离法3.超临界流体萃取技术,超临界流体（supercritical fluid,SF）是指某种气体（液体）或气体（液体）混合物在操作压力和温度均高于临界点时，使

26、其密度接近液体，而其扩散系数和黏度均接近气体，其性质介于气体和液体之间的流体。超临界流体萃取法（supercritical fluid extraction,SFE）技术就是利用超临界流体为溶剂，从固体或液体中萃取出某些有效组分，并进行分离的一种技术。超临界流体萃取法的特点在于充分利用超临界流体兼有气、液两重性的特点，在临界点附近，超临界流体对组分的溶解能力随体系的压力和温度发生连续变化，从而可方便的调节组分的溶解度和溶剂的选择性。,三、脂类药物的精制 经分离后的脂类中常有微量杂质，需用适当的方法精制，常用的有结晶法、重结晶法和有机溶剂沉淀法。,第三节 发酵工程生产脂类药物,发酵工程生产脂类药

27、物是利用微生物在最适宜条件下把糖等底物转化成脂类化合物的现代生物技术。,碳水化合物,柠檬酸,苹果酸,丙酮酸,PK,PFK,葡萄糖,丙酮酸,乙酰辅酶A,草酰乙酸,苹果酸,草酰乙酸,乙酰辅酶A,丙二酸单酰辅酶A,脂酰辅酶A,甘油三酯,柠檬酸,异柠檬酸,-酮戊二酸,继续TCA循环,线粒体膜,TCA循环,EMP途径,ACC,FAS,PD,PC,CS,线粒体膜,细胞质,微生物生产脂类的优点,1.微生物适应性强，生长繁殖迅速，周期短，代谢活力强，易于培养，易于改良，遗传稳定。2.微生物生产脂类占地面积小，不受场地、气候、季节限制，能连续大规模生产，所需劳动力少。3.微生物生长所需原材料丰富、价格便宜，如：

28、乳清、糖蜜、废糖液、淀粉生产中的废液和废料、木材糖化液、亚硫酸纸浆等，均可利用，又可保护环境。4.微生物脂类生物安全性好。,第四节 大豆磷脂,一、化学组成与性质 豆磷脂是多种磷脂的混合物，主要含卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂，还含相当量的三酰甘油、游离脂肪酸及糖类化合物等。呈浅黄或浅棕色，无味或有些许气味，极易吸潮，变粘稠至蜡状。不耐高温，80变棕色，120分解。能溶于乙醚、苯、三氯甲烷等有机溶剂，也溶于脂肪酸和矿物油，不溶于丙酮，部分溶于乙醇。,二、生产工艺,1.从豆油中提取豆磷脂的制备工艺 大豆油 磷脂化合物 粗磷脂 豆磷脂成品,（水合）2%3%H2O50 70,分离,干燥,2.注射用豆磷脂的制备工艺粗磷脂 沉淀物 提取液 上层提取液,注射用豆磷脂,浓缩液,滤液,（脱脂）丙酮,（提取）95%乙醇回流1h，5次,（吸附）Al2O3回流1h,（脱色）活性炭 回流1h,浓缩减压,（脱色、脱油）活性炭、丙酮,