植物基因克隆的载体.ppt

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1、第三章 基因克隆载体Vectors,载体(vector)：在基因工程中，携带目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的DNA分子。,一、载体的概念,作为载体使用的必须是能进入植物寄主细胞内进行复制和表达的核酸分子。,二、载体的功能,1、运送外源基因高效转入受体细胞；2、为外源基因提供复制能力或整合能力；3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。,三、发展概况,1.第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivar et al)2.第二阶段：增大载体容量（降低长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因

2、。如pUC系列载体。3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,按载体性质分,四、分类,质粒载体、噬菌体载体和人工染色体,目前发展起来的植物基因转移的载体系统分为两大类：一是病毒载体系统 二是质粒载体系统,（1）有复制起点（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点（3）具备合适的筛选标记（4）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小（6）在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化 表示载体必须具备的条件,五、基因工程载体必须具备的条件,第一节 质粒载体,一、质粒(plasmid),独立于细菌染色体外

3、的能独立复制的双链闭合环状DNA分子,细菌中发现，偶见于链霉菌和酵母比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。,大肠杆菌的质粒,二、质粒的发现和命名,1946年，第一个被发现的细菌质粒是大肠杆菌的F因子，它的发现对细菌遗传学的发展产生了深远的影响。1957年，日本学者报道了志贺菌(Shigella)中质粒介导抗生素抗性的转移现象。,（一）质粒的发现,在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能

4、分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。,二、质粒的发现和命名,（一）质粒的发现,（二）质粒的命名原则,质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和性差异划分为不同的类型。最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名，如F因子(fertility factor，致育因子)、R质粒(resistance factor，抗性质粒)和Col质粒(colicin，大肠杆菌毒素质粒)等。,随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质粒的微生物新类群和新质粒被发现，但由于缺乏统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。,其规则是：质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第一个字母一律用小

5、写p表示，后两个字母应大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒，如pBR322、pUC18和pUC19等。,直至1976年Novick等才提出一个可为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则。,（二）质粒的命名原则,命名举例,pBR322是最早构建的质粒之一“p”表明它是一个质粒“BR”表示最初构建它的两个人的名字首字母：Bolivar和Rodriguez“322”区别于该实验室构建的其他质粒，如pBR325、pBR327等,三、质粒的基本特性,（1）质粒分子较小,一般为1-200Kb，最大的可达1400kb(如苜蓿根瘤菌质

6、粒pRm141a)。,（2）编码特性表型多样化,如抗生素的抗性、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒素）、合成限制性内切酶或修饰酶、生物固氮和杀虫等。,3、质粒的存在形式,体外理化因子作用下可形成下列形式开环DNA分子(oc-DNA)线性DNA分子(l-DNA)超螺旋DNA分子(scDNA),生理条件下：以共价闭合环状DNA分子(Covalent close circular,ccc-DNA)形式存在,三、质粒的基本特性,在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子（ss-DNA）。,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA

7、最慢。,（4）质粒空间构型与电泳速率,三、质粒的基本特性,（5）自主复制性,携带有自己的复制起始区（ori）控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制,（6）不相容性,同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容，不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存,（7）可扩增性,质粒就其复制方式而言分为两类 松弛型复制 严谨型复制,（8）可转移性,在天然条件下，大多质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内。非结合细菌可通过人工方法进行转化,（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”在宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存

8、下去。（2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。（3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿主细胞的补偿（“交房租”）。（4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关的，如抗生素抗性基因。,四、质粒与宿主细胞的关系,五、质粒载体的构建,（一）为什么要进行质粒载体的构建？,天然质粒载体具有一定的缺陷,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足基因工程中克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,方法：重组

9、，“拼拼接接，挖肉补疮”,（1）pSC101，第一个用于基因克隆的天然质粒，分子长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。,分子量大，拷贝数低,（2）ColE1质粒筛选标志不理想,ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞.,（二）构建质粒克隆载体的基本策略,1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝。2、含有尽可能多的克隆

10、位点。3、含有供选择克隆子的标记基因。4、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。,五、质粒载体的构建,（三）质粒克隆载体的设计和构建过程的原则,选择合适的出发质粒（亲本质粒）。正确获得构建质粒克隆载体的元件。组装合适的选择标记基因。选用合适的启动子。在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构建过程力求简单。,四、常见的人工构建的质粒载体,pBR322是F.Bolivar和R.L.Rodriguez于 20世纪70年代后期构建出来的，也是第一个经人工改造的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，应

11、用广泛。现在已经被许多更优良的新型克隆载体所替代。,（一）pBR322系列,pBR322的结构,pSP2124质粒的Ampr基因,（1）元件来源,复制起点 ori,pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点,Ampr基因,Tetr基因,pSC101的Tetr 基因。,（2）长度,4363bp,（3）选择标记,氨苄青霉素和四环素抗性。,（4）克隆位点,其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind、Sal I）；3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。,24个克隆位点。,（5）pBR322的优点,双抗菌素抗性选择标记,插入失活，分两次先后选择：,没有获得

12、载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。,获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。,外源基因BamH I,Amp中存活,但在Tet中死亡,外源基因Pst I,Tet中存活,但在Amp中死亡,加入氯霉素之后，每个细胞可达10003000copy,安全,失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。,高拷贝数,分子小，克隆能力大,载体越小越好。10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。,删除mob识别位点,（如质粒pBR327、pAT153等）。,pAT153：,从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。,（7）PBR322

13、的改进,pBR325：,在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也带一个EcoRI位点。,使EcoRI 也成为插入失活型位点。,改造EcoR I 位点,（二）pUC系列,University of California的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。,pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19,pUC18/19的结构,复制起点：来自pBR322质粒。Ampr基因：来自pBR322质粒lacZ的启动子：来自大肠杆菌lacZ基因：大

14、肠杆菌lacZ的-肽链序列，是LacZ 的氨基端片断多克隆位点：10个连续的单酶切位点，位于lacZ基因的5端。,pUC18/19的结构,pUC18/19质粒载体的优点,更小的分子量：如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。选择方便：X-gal显色、抗菌素双重直接选择。克隆便利：具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。测序方便：pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。,选择原理,Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。蓝白斑筛选,X-gal,（5-Bromo-4-chloro-3

15、-indolyl-D-galactoside）是-半乳糖苷酶的作用底物,-半乳糖苷酶作用于X-gal显色反应,-半乳糖苷酶能把无色的化合物X-gal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝,诱导物：IPTG,IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ肽都表达，从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，不能产生肽！,lacZ的肽互补,-肽（lacZ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。pUC质粒载体上的lacZ 编码的肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”

16、，使它能形成4聚体，又能分解X-gal，产生蓝色物质。,质粒克隆载体引入与lacZ互补的E.coli，在含IPTG和X-gal的诱导培养基中，菌落呈蓝色。如果在MCS区插入一个外源片断，就会使lacZ基因失活，引入 lacZ互补的E.coli，肽不能生成，就无所谓互补，在含IPTG和X-gal的诱导培养基中X-gal不会被降解，菌落呈白色。,IPTG诱导的结果：蓝白斑筛选,MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑,通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。,IPTG诱导的结果,（三）农杆菌Ti质粒表达载体,Ti（tumor-inducing plasmid）质

17、粒：根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，Ti质粒中有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA），能转移并整合到植物基因组中，并导致冠瘿瘤的形成。大小因种类而异，在200-250kb之间。,章鱼碱型农杆碱型农杆菌素型琥珀碱型,Ti质粒分为4个功能区,T-DNA区：是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，含有编码植物激素和冠瘿碱的基因 Vir区：Vir区上的基因能激活T-DNA转移，使根癌农杆菌表现出毒性 Con区：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移 Ori区：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制

18、。,Ti Plasmid,T-DNA 区,Left border,Right border,vir 区,Ori区,Con区,T-DNA区,Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约25kb。能转移到植物细胞内的DNA片断称为T-DNA（transfer-DNA）T-DNA左右两端边界各有一个25bp长的正向重复序列(左边界，右边界)，在不同Ti质粒中高度保守。边界序列对T-DNA转移和整合不可缺少；已证实只要保留两端边界序列，虽然中间序列不同程度被外源片断所替换，仍可转移整合到植物基因组中 Ti质粒遗传转化的理论依据。T-DNA进入植物细胞后，能以单拷贝或多拷贝形式随机整合到染色体DNA上。且T-

19、DNA上的基因能被植物转录系统识别，进行转录。,在T-DNA区已鉴定出多种基因,章鱼碱合成基因（ocs）或胭脂碱合成基因（nos）或其他胭脂碱合成基因。细胞分裂素合成基因位点Shi 和 控制植物生长素合成的基因位点Roi。在两种基因表达产物的共同作用下，破坏植物内源激素的平衡，干扰植物细胞的正常分裂，引发植物产生肿瘤。,Vir 区,Ti 质粒T-DNA上游的一组基因，表达产物可激活T-DNA向植物细胞转移，引发肿瘤，显示致病性。,Con区,含有与农杆菌之间接合转移有关的基因，受宿主合成的冠瘿碱激活，使Ti质粒在细菌间转移。,Ori区,调控Ti质粒的自我复制,Ti质粒介导转化的过程,根癌农杆菌对

20、植物细胞的识别和附着根癌农杆菌对植物信号物质的感受根癌农杆菌Ti质粒上的vir基因以及染色体上操纵子的活化 vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝，T-DNA复合体的产生T-DNA复合体在RB序列的引导下定向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中,Ti质粒介导转化植物细胞示意图,天然的基因工程,天然的基因工程,1、Ti质粒是一种天然的质粒表达载体，外源基因组装在T-DNA上，有可能引入植物细胞。2、转基因的细胞只能分裂，而不能分化成植株，不能达到选育转基因植物的目的。3、

21、通过改造T-DNA，构建了一系列Ti质粒表达载体。,Ti质粒本身存在的缺陷,转化细胞在生长过程中会产生植物激素，从而破坏受体激素的平衡，阻碍转化细胞的再生，因此需将参与合成植物生长素和细胞分裂素的基因剔除冠瘿碱合成基因对转基因植物意义不大，因此也可删除Ti质粒分子量过大（200800kb），小一些利于操作，因此可除去不必要的大片段DNA需加入大肠杆菌复制起始位点，以利于在大肠杆菌中的操作和保存,pCAMBIA 1300 图谱,穿梭质粒载体,人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。,常用的穿梭质粒载体,大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌酿酒酵母

22、穿梭载体 大肠杆菌动物细胞穿梭载体,穿梭质粒,能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。很多酵母菌的穿梭载体，用于功能互补法分离、鉴定真核生物基因的研究,穿梭载体的优点,利用大肠杆菌进行基因克隆、表达 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。,TA克隆载体（T载体）,由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，用于PCR产物的克隆和测序。原理：利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作

23、用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。优点：操作最简单，快速和高效，是Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法,TA克隆的优点,不需使用含限制酶序列的引物不需把PCR产物做平端处理不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。,注意事项,1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。,pMD18-T图谱,pSK-T载体图谱,pSK-T vector两侧的3端，具有突出的碱基T，可以和PCR产物3末端的A碱基互补，从而大大提高PCR产物的连接、克隆效率。可

24、通过互补的颜色反应来筛选重组子,pUC18-T克隆载体图谱,pUCm-T克隆载体图谱,多功能质粒载体,载体具有多种功能，根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。pGEM 系列质粒载体就是一类多功能载体，如：pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM4Z、pSP64、pSP65、pGEM3Zf。,pGEM系列载体,pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体。在其总长度为2743bp的基因组DNA中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。,

25、pGEM3Z载体,pGEM3Z与pUC载体非常相似，其不同点：pGEM3Z含有两段额外的短的DNA片段，每一段可以作为RNA聚合酶的识别位点。这两段启动子（噬菌体SP6T7)存在于限制性内切酶的两端，这意味着如果在重组的pGEM3Z载体中加入RNA聚合酶，可以发生转录。合成的RNA可以作为探针使用，或者研究RNA的加工过程或者蛋白质的合成。,1、克隆载体，全长3.19kb，具有Amp抗性基因和复制起始点2、MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子-可进行体外转录；为插入片段的测序提供特异引物位点3、MCS为于lacZ基因内部（插入失活）蓝白斑筛选4、引入丝状噬菌体f1(+)复制起始点-可以产生单链DNA，并分泌至上清中，,