肾脏疾病遗传学研修班.ppt

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1、肾脏疾病分子遗传学,张 宏,北京大学第一医院肾内科北京大学肾脏疾病研究所,人类的染色体,人类基因组计划,1953James Watson and Francis Crick discover the double helical structure of DNA(Nature).,2001The HGP consortium publishes its working draft in Nature(15 February),and Celera publishes its draft in Science(16 February).,人类基因组计划基因组医学（Genomic Medicine

2、)成为医学研究的主流,诊断 治疗 预防,环境因素,遗传因素致病基因相关基因易感基因,疾病的发生发展,基因病,单基因病,多基因病,获得性基因病,基因病,经典孟德尔遗传病,多基因多因素疾病,遗传性疾病 先天性疾病 遗传性疾病 家族性疾病,经典遗传病-Mendelian Traits,常染色体显性遗传 常染色体隐性遗传 性染色体遗传,符合垂直传递、先天性和家族性特点由单基因的变异或突变所致,非经典遗传病-Complex Traits,基因以及基因与环境因素的 相互作用影响疾病的发生、发展、治疗反应和预后,涉及一个以上的致病易感基因发病机理十分复杂,GENETIC SYMBOLS,GENETIC SY

3、MBOLS,家系谱图例,男女发病机率相等 父、母有一方患病，子女获得疾病基因的可能 性为50，基因携带者必发病 非患病的子女不携带致病基因，其子女（孙代）不会发病，亦即不会隔代遗传。,常染色体显性遗传,父母双方均携带遗传基因才有可能使子女发病（发病率为25，基因传递率为50）父母本身均不患病，可能发现患者的父母是血缘性婚配,常染色体隐性遗传,遗传与性别有关 父患病，将致病基因传给女儿，儿子不会患病,XX,XY,XX XY XY XX,XY,性染色体显性遗传,肾脏遗传性疾病,遗传性肾小球疾病遗传性肾小管疾病遗传性囊性疾病染色体异常性疾病,遗传性肾脏疾病分类（1）,肾小球损害为主要或唯一表现 Al

4、port 综合征 Xq22.3，2q36-37 薄基底膜肾病 2q36-37，Xq22 先天性肾病综合征 19q13 家族性肾病综合征19q13;11q21-22;1q25-31 家族性IgA肾病 6q22-23,遗传性肾脏疾病分类（1）,主要累及肾小球的遗传性疾病 Fabry 病 Xq21-22 甲髌综合征 9q34 肝纤维化伴肾小球病 糖原累积病 家族性脂蛋白肾病,遗传性肾脏疾病分类（2）,以肾小管/间质损害为主要表现 Bartter 综合征 Liddle 综合征 家族性间质性肾炎 特发性 Fanconi 综合征.,遗传性肾脏疾病分类（3）,肾脏囊肿性疾病 成人型多囊肾病PKD1(16p1

5、3.3)PKD2(4q21-23)PKD3?婴儿型多囊肾病6p12,13q12 髓质囊性病1q21 Bourneville氏病 Lindau氏病 Wilms瘤.,遗传性肾脏疾病分类（4）,染色体异常型肾脏病 染色体三体 染色体缺失或重叠肾脏不发育/发育不良 异位肾 结节状胚胎肾/分叶肾集合管囊性扩张肾胚胎细胞瘤双肾盂或双输尿管,成人型多囊肾Adult Polycystic Kidney Disease(APKD）,最常见的遗传性肾脏病 发病率：1：1000 中国有约有130万患者 肾功能受损 85%90%的患者4060岁进入ESRD 占ESRD患者的510%,肾脏,心脏,颅内动脉,结肠,肝脏,

6、脾脏,胰腺,肾外表现多器官受累,ADPKD临床诊断标准,超诊断ADPKD的标准,直接诊断：检测特定基因的存在和/或变异间接诊断：利用RFLP进行家系连锁分析,基因诊断的途径,ADPKD致病基因的特性,PKD1位于16p13.3基因全长14.5 Kb,PKD2位于 4q21 基因全长5.6 Kb,Polycystin-1是作为一种膜蛋白受体，能够结合并与多种蛋白、糖类和脂类相互作用，通过磷酸化途径导致细胞内的各种反应；而Polycystin-2是一种钙通透性通道,462 KD,110KD,PKD 的基因诊断基础,PKD 症前、产前诊断必备条件,完整的家族史（家系图）可靠的临床资料（影像学结果）家

7、系成员的外周血DNA 家系成员：至少有两代人 至少有两个以上 PKD 患者 至少有两个 30 岁的正常人,与ADPKD相鉴别的常见遗传性肾脏囊肿性疾病,收集家系,绘制家系图,检索相关数据库,收集家系成员表型,已报告的疾病尚未报告的疾病,OMIM:http:/www.ncbi.nih.gov/omimGeneCard:http:/bioinfo.weizmann.ac.il/cardsHGMD:http:/www.uwcm.ac.uk,单基因遗传病研究策略,经典遗传性肾脏疾病的研究进展,发现新的致病基因/位点Nephrin,Podocin,IGAN1,IGAN2,已知致病基因的功能研究Polyc

8、ystin1 Polycystin2Nephrin,Podocin,遗传异质性研究基因的突变筛查基因的突变与临床表型的关系基因诊断及遗传咨询症前、产前诊断基因治疗替代治疗,非经典遗传病-Complex Traits,基因以及基因与环境因素的 相互作用影响疾病的发生、发展、治疗反应和预后,涉及一个以上的致病易感基因发病机理十分复杂,IgAN遗传学研究多因素、多基因疾病研究策略,IgA肾病是一种多基因遗传病 IgA肾病致病/易感基因未明,IgAN是一种多因素多基因复杂性状疾病,Gene,Environment,Distribution,1978年Tolkoff-Rubin等首先报道家族性IgA肾病

9、1984年英联邦3.8%IgAN有肾病家族史1989年美国18%为家族性IgAN1999年意大利北方家族性IgAN占14%肾病2001年意大利北方50%的IgAN呈家族聚集2002年本研究所8.7%的IgAN呈家族聚集,家族性IgA肾病的研究,家族性IgA肾病的定义,IgAN 患者至少3代亲属进行尿常规检查 散发性IgAN 是指患者所有亲属尿检均正常 家族性IgAN 是指患者家族中至少有两个经肾 活检证实的IgAN 患者可疑家族性IgAN 是指患者亲属中有镜下血尿/蛋白 尿/无其他原因的肾衰竭患者,Nature Genetics 26,354,2000,MH15.6%,P3%,MH+P 4%,

10、77.4%,A,MH+P 0.3%,P2%,MH 2%,95.7%,B,F.P.Schena Kidney Int.48,1998,IgAN家族成员尿异常检出率研究,269/48 FAMILIES,8255,家系研究(1988-2000),家系（110),散发性IgAN54,家族性IgAN19,可疑家族性 IgAN 37,F.P.Schena，JASN 2002,49%,51%,家族性IgA肾病发生率,吕继成 张宏 王海燕等，中华内科杂志 2003,I:2,II:1,II:3,II:4,II:5,II:6,III:1,III:2,II:2,I:1,Pedigrees,46(71.9%)of t

11、he 66 kindred was multiple generation involvement,18(28.1%)of the 66 kindred was single generation involvement,Pedigree I,Pedigree II,研究策略,Linkage Study,家族性 IgA肾病,散发性 IgA肾病,Association Study,以家族性患者为研究对象，利用孟德尔遗传定律,通过遗传标志，建立数学模型，进行基因定位。,以散发病人为研究对象，重点是多基因遗传病，根据发病机制，筛选候选基因，通过病例对照研究，验证致病/易感基因。,Linkage St

12、udy,以家族性患者为研究对象，利用孟德尔遗传定律，通过遗传标志，建立数学模型，进行基因定位。,家族性IgA肾病的基因定位,IgA nephropathy,the most common cause of glomerulonephritis,is linked to 6q22-23.,Italy24USA6Total30,Nature Genetics 26,354,2000,Chromosome6q 22-23 IGAN1 locus(6.5-cM)D6S 1040LS 3.7,Italian 58%USA 66%China3/8,Replication Study in Chinese,

13、8 families 20 cMD6S 25 markers,Alpha:0.5P-value:0.005,3 families linked to IGAN1Replication Lod:1.7 Total Lod:7.3,Physical map of IGAN1,No obvious candidate genes in 6.5 cM interval,Genome Wide Scan,SNPs coverage:average spacing 0.32 cM,Microsatellite coverage:average spacing 9 cM,4q22 LOD=4.0(5cM),

14、Localization of a Novel Susceptibility Loci based on familial IgAN,Canadian2q36 Italian4q22 Singapore7q33 Chinese 4q22,家系连锁分析中的问题,家系的大小家系成员表型的确定费用精确定位功能研究,Association Study,以散发病人为研究对象，重点是多基因遗传病，根据发病机制，筛选候选基因，通过病例对照研究，验证是否为致病/易感基因。,IgA肾病是多基因多因素复杂性状疾病,Genetic Association Study,HLA-Bw35,HLA-DQB1T-cell

15、receptor(TCR)andchain ACE,ATR1TGF1，THF,eNOSUteroglobinIL-10,PAI-1,MCP-1,P-selectin,Megsin,NPHS1,IL-1Ra,文献中IgA肾病基因多态性研究涉及的主要候选基因和结果,样本量（1000以上，P0.00001）表型分型侯选基因的选择多基因交互作用与遗传统计学处理,相关分析中的主要问题,Holly k.Tabor,Nature Reviews Genetics 2002,候选基因,疾病人群,对照人群,样本量样本的均一性,Association Study,Springer Semin Immunopath

16、ol 2003,24:477-93Kidney Int,2004,65:1544-1547 J Am Soc Nephrol 2005,16:2088-2097,IgA或以IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜区沉积（免疫病理）,IgA 肾病,IgAN 发病机制研究进展,结合符合受体-配体反应Jacalin亲和层析，热聚合IgA1放射配基法饱和性、特异性、剂量依赖性患者与正常人血清IgA1患者IgA1的结合力更强患者IgA1刺激MHC增殖的效应更强患者IgA1刺激MHC分泌细胞外基质更多,Wang et al.Clin Exp Immunol 2004;6:168-175王悦等。中国病理生理杂志

17、2002;18:1101-1104王悦等。中华医学杂志 2002;82:1406-1409 王悦等。中国病理生理杂志 2004;20:1025-1029,IgA1 和HMC受体的结合,PEG6000,原始血清正常人轻系膜增生硬化,上清,沉淀,Xu,et al.Clin Exp Immunol 2005;142:569-575,患者血清中IgA1分子存在糖基化缺陷上清中IgA1分子无糖基化缺陷沉淀中IgA1分子存在糖基化缺陷不同病理类型存在差异增生硬化患者沉淀中IgA1分子唾液酸和半乳糖均缺陷轻系膜患者只有半乳糖缺陷,糖基化缺陷的血清IgA1分子易于聚合成大分子血清IgA1分子糖基化缺陷与病理类

18、型相关,去除唾液酸和半乳糖的IgA1易形成多聚体,多聚体增加结合力，结合分子数/细胞Fn分泌并未增加单体失去特异性结合能力,Gao,et al.Clin Immunol submitted,单体和多聚体与HMC结合的特征不同,107例IgA肾病患者血清IgA1分子糖基化程度患者IgA1 的2,6唾液酸和半乳糖显著低于正常人局灶增生硬化的IgA1糖基化缺陷显著重于轻系膜,Xu LX et al.Kidney Int 2005;68:167-172,IgA1分子糖基化异常与IgA肾病病理类型的相关,Ding JX,et al.Clin Immunol 125(2007)268-274,128例Ig

19、AN患者 随访8年根据血清-2,6唾液酸水平分组相对正常组(n=107)，平均随访4724月严重缺失组(n=21)，平均随访6322月,IgA1分子2,6唾液酸缺失与患者预后相关,IgA肾病患者外周血B淋巴细胞 ST6GALNAC2 mRNA 的表达较正常对照降低 基因表达及酶的活性与外周血中IgA1分子2,6-唾液酸水平呈正相关,B淋巴细胞唾液酸转移酶的表达和活性下降是患者低唾液酸的主要原因,Scandinavian Journal of Immunology.2008,in press,候选基因,研究对象,IgAN patients:670 IgAN patients confirmed

20、with by immunopathologyControls:494 geography-matched,ST6GALNAC2和NEU1基因中的多态性位点及其特点,ST6GALNAC2基因单倍型与IgAN易感性的关联分析,Bonferroni校正：P 0.0071有统计学意义,IgAN患者ST6GALNAC2基因单倍型与血清IgA1分子2,6唾液酸水平的关系,经过eGFR及性别联合分析,ST6GALNAC2基因启动子区-1049至-935的区域对于ST6GALNAC2基因的转录有明显的正性作用,ADG单倍型较GDG单倍型有显著的低转录启动活性,P=0.002,Zhu L,et al.Subm

21、itted,ST6GALNAC2基因单倍型功能验证,ST6GALNAC2基因启动子区ADG单倍型为功能性多态位点,调控2，6唾液酸转移酶表达,IgA1分子2，6唾液酸化,IgA肾病易感性,b-1,3半乳糖转移酶的编码基因C1GALT1 的YATIG，YAGDA和YATDG的单倍型与IgA肾病的易感性相关,Li GS,et al.Kidney International 2007,71:448-453,ST6GALNAC2 和C1GALT1 基因间的单倍型-单倍型交互作用增加了IgA肾病患者的发病风险,Illustration for potential mechanism of the int

22、eractive effect of variants in C1GALT1 and ST6GALNAC2 on IgAN,IgAN发病机制,SNP筛选,IgAN易感性相关基因型,确定候选基因,关联分析,基因型-表型分析,功能验证,IgAN Association Study,Kidney International，2007;71:448-53,MUCINUteroglobinCHGA,NPHS1NPHS2,ST6GalNAc II C1GALT1,COSMCSIAL1TfR1,IgA肾病是多基因多因素复杂性状疾病,表型性状的高度异质性-样本量（1000以上，P0.00001）及更多的家族聚

23、集性患者的收集多种基因的共同参与和交互作用-发病机制中多个发病环节侯选基因的选择-多基因交互作用与遗传统计学分析研究策略和技术支持-Human Genome Project-Single Nuclear Polymorphism Project-Programs for Genomic Applications Project-HapMap Projec-Copy number variants(CNVs)不同人群的验证和功能研究,多基因复杂性状疾病遗传学研究现状,Finding Genes That Underlie Complex Traits，Science,2002,*诊断准确、完整、并可随访的相当数量的 临床资料；*与临床资料相匹配的完整的遗传学资料；*与临床资料相匹配的病理组织资料；*与临床资料相匹配的DNA/RNA资料；*上述资料完整有序地分类储存；,肾脏病医生面临的机遇和挑战,数据库的建立,建立于国际互联网之上的肾脏疾病患者数据库临床信息（Clinical Information)标本库（Samples Bank）病理组织、血清/血浆、尿液、DNA建立了患者的长期随访系统利用互联网优势，建立资源共享的信息网络,肾脏疾病数据库特点,致谢,感谢为数据库收集和整理做出贡献的所有人员感谢所有提供标本的患者及健康自愿者,2009年2月 北京,