原料药质量研究(上海药检所谢沐风).ppt

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1、谢沐风 上海市食品药品检验所,原料药注册与生产现场检查培训班,请大家将手机调至“振动”档！谢谢您的配合！,工 作 简 历,1998年至今 在本所化学室工作。经历了“1998年2002年的强仿期”和“20032006仿制药疯狂期”2003年8月 2004年2月 赴日本国立医药品食品卫生研究所药品部（相当于我国中检所化药室）进修。发表了多篇方法类、思路类文章，引起业内瞩目与同仁共鸣。(1)如何建立HPLC(TLC)法测定有关物质方法；(2)如何建立HPLC法测定含量方法；,与企业和研发公司交流经历 走访/核查过全国上百家制药企业；时常与同仁们相互交流、切磋；深谙目前国内制药企业技术现状与薄弱环节。

2、2009年伊始、在国内知名药学网站 丁香园“药物制剂版”上创立“溶出度研究”子版，引起业内瞩目。,我们已经走得太远，以至于忘记了为什么而出发。黎巴嫩著名诗人纪伯伦（18831931）,工 作 感 悟,本 人 体 会,工作中一定要注重思考，带着问题去学习、有的放矢地去攻读，多观察、多领会，日积月累、潜移默化之中就会水到渠成。思维要开放、活跃，不要固步自封、按部就班，因循守旧。一定要不断思考，注意查询文献，收集各方面信息，培养自身的专业素养与专业敏感度，不要怕遇到问题，越是遇到问题、将其解决，就越能不断提高与进步。,注重培养个人的专业素养与敏感度,http:/国家新药审评中心网站http:/国家局

3、网站http:/国家药典委员会网站http:/中国知网http:/维普数据库http:/丁香园专业网站,切忌：闭门造车、闷头蛮干！,很荣幸此次来到京城与各位同仁相互交流、学习！感谢国家药监局培训中心搭建平台！,寄望大家多思考、多提问！寄望能学以致用，为大家工作献计献策、呈上绵薄之力！,【溶解度】会因结晶溶剂的不同导致结果的差异性，一般不做硬性规定，酌情处理。只是操作时样品一定要研细后进行。【晶型】如研究表明：各晶型具有相同表观溶解度，或者各晶型皆易溶于水，此时各晶型一般不会影响药物的体内生物利用度，便无需拟定。如各晶型具有不同表观溶解度，即有属于低溶解性的晶型，此时则应在质量标准中拟定晶型检测

4、。一般采用X-射线衍射法。有时亦能采用红外予以明辨。列举质量标准中已有拟订的“阿德福韦酯”和“那格列奈”实例。（仪器校正）,【红外鉴别】观测2500cm-1-400cm-1波数段间8大主峰波数。峰间高低可以不一。个别小峰允许存在，是杂质存在的体现。【荧光分析法】响应值不稳定，有时会波动较大，不建议使用。,【熔点测定法】试验结束后切勿立即切断电源，设置为室温，使其自然降温，之后再关闭电源。熔距越短或终熔点越接近高限、纯度越高。【紫外-可见分光光度法】比色法测定时、一定要平行操作，测定时迅即完成，切忌等待吸收度值稳定后再行记录！,【旋光度测定法】温控尤为重要！先将溶剂置于该温度水浴中，随后采用该溶

5、剂快速配制溶液，定容后立即测定。【氧瓶燃烧法】样品一定要燃烧完全。若氧气充满、尚无法燃尽，可将样品量减半，在其后的测定中再将浓度增加一倍，即可。,【溶液的澄清度与颜色、氯化物、硫酸盐、重金属检查等】建议配制梯度对照液，这样可对样品进行一个全面、综合分析。【炽灼残渣检查法】炽灼后放置于干燥器内的时间不得少于1小时，否则称重不稳。【崩解时限】胶囊剂有时会出现胶囊壳存留于网底的情况，可将囊壳取出，若其中无内容物，亦可判断为合格。,【干燥失重和水分】,(1)一些缓慢降解的物质、不易采用恒重，规定时间。一般105、3小时肯定已可以！典型案例盐酸西布曲明，见下。(2)带有结晶水的药物，尽量采用卡氏法测定。

6、,其中的环丁基较为“脆弱”，不断缓慢分解。应采用卡氏法测定。,残留溶剂研究思路,研究原则：合成过程中使用到的有机溶剂均需建立测定方法、并予以研究测定。观测样品测定结果：申报3批样品测定结果说明工艺稳定性。质量标准拟定原则：除第一类溶剂外、“未检出的溶剂”可以不拟定，仅拟定最后一步重结晶溶剂。测定方法：根据研究检测结果，质量标准方法完全可以与研究时方法不同。,残留溶剂研究思路,质量标准拟定原则：如仅残留有重结晶溶剂、且为低沸点（如乙醇、丙酮等），完全可采用105干燥失重方法予以替代。从而省略掉气相测定，且干燥失重限度可酌情放宽。质量标准是一个不断完善的过程：列举“自套枷锁”、“事倍功半”实例！列

7、举阿法骨化醇无需研究测定实例！,气相色谱法测定时应注意事项(1)强烈建议男同志从事此项工作。将对照品溶液浓度配制为限度点。对于二氯甲烷、三氯甲烷采用氢火焰检测器(FID)勉为其难、应采用电子捕获检测器(ECD)。如要强行检测，可采用的办法有：直接进样、加大流速，使峰形便尖锐、从而提高峰面积积分精密度。供试品溶液一定要全部溶解。对于一些高沸点和低沸点的残留溶剂，不推荐采用顶空法进样！尽可能建立内标法、而非外标法。,气相色谱法测定时应注意事项(2)对照品溶液配制法（引申至对照品为油状时）。直接进样法与顶空法的优缺点比较。定性时、多根色谱柱使用的意义。色谱柱选择的一定要遵循“极性相似”原理。直接法进

8、样样品溶液后，进样针极易堵塞。自动进样器时设定几针溶剂，冲洗时多洗几次。试验结束后用乙醇浸泡进样针。,容量分析法测定含量,(1)滴定液的标化与贮藏 氢氧化钠滴定液标化后一定要分成小塑料瓶、密闭包装。使用时，酌情（针对放置时间和样品之类）再标化一份即可。因其极易吸收空气中的二氧化碳，使校正因子降低，消耗过多滴定液，从而使结果偏高，有时会出现高于101.0%情况。高氯酸滴定液应临用现标。使用当天标化三份，取均值即可。不常用滴定液建议购买，如甲醇钠滴定液等。,容量分析法测定含量,(2)滴定液的消耗体积 针对不同消耗体积采用不同规格滴定管(10/26/50ml)对于消耗量小于误差要求的最小体积时，可采

9、用稀释滴定液、增加消耗体积的办法；或采用电位滴定仪。(3)指示剂使用注意点 部分指示液配制后，如放置时间过久，其变色会迟钝，导致消耗体积过大，结果偏高；故配制后酌情放入冰箱中。,容量分析法测定含量,(4)操作中的注意事项 对于采用指示剂法测定的操作，只要有空白试验，样品变色后的色泽一定要与空白色泽一致，以消除系统误差。(5)容量分析法与HPLC法介绍（引申至对照品质量标准）容量分析法：专属性差、人为因素较强；但省时省力。HPLC法：专属性强；但定量结果会因波长不同存在较大偏差，因杂质与主成分的响应因子不同,电位滴定法测定含量,对于指示剂变色难以辨明时 样品溶液变色存在干扰（有辅料或沉淀存在等）

10、消耗体积很少、无法采用滴定管定量。杂质和主成分对照品的标化方法。设定的滴定参数应使滴定曲线呈现平滑，以避免滴 定终点的误判。即如何确定合适的“阈值”：先全程滴 定，根据突跃变化情况，确定阈值后再次滴定，尤其 是进行两个突跃点的滴定时（引申至新版药典）。,高效液相色谱法应用时经常出现的问题,柱温箱一定要配制。试验温度建议在30-50。清洗温度可高于试验温度5。色谱柱清洗：对于正相、实验结束用流动相再冲洗半小时即可。对于反相，除非流动相采用单纯的甲醇/乙腈-水，其他所有流动相皆建议先用纯水冲洗半小时（流速1.0ml/min），再改用20%甲醇冲洗半小时，随后取下、两头密闭即可。绝不推荐,液相色谱仪

11、：绝不建议为节约乙腈/甲醇，而采用两个泵，将水相与有机相分别注入混合的方式（即便配置了脱气机）。一定要将两相按比例混合后脱气过滤，采用一个泵注入，且清洗时一定就清洗使用泵，不建议采用另一个泵将清洗液注入（重点讲述！）过滤膜一定要采用混相膜。正相流动相无需过滤、混合均匀后超声即可。,高效液相色谱法应用时经常出现的问题,梯度洗脱时 最理想方式：A相位高比例的水相兑低比例的有机相；B相为低比例的水相兑高比例的有机相；其次：A相位高比例的水相兑低比例的有机相；B相皆为有机相。绝不建议A相位纯水相、B相位纯有机相，即便质量标准如此拟定，采用一元一次函数，将其转换成第二种情况，否则极易出现基线飘动、无法准

12、确积分的现象。,高效液相色谱法应用时经常出现的问题,梯度洗脱时，必须先行测定空白溶剂峰，应基线平稳、溶剂峰出峰在前。确认色谱柱内清洗干净后再测定样品。以确保有关物质检测时，杂质的准确测定。,高效液相色谱法应用时经常出现的问题,高效液相色谱法测定含量,(1)对照品溶液配制2份（2份粉末）分别进样3针，计算校正因子f=C/A，随后计算f的RSD，小于2.0%即认为2份对照品溶液配制均无误、且仪器已稳定。取f均值测定样品。(2)样品溶液亦配制2份，每份进样一针，两份百分含量差值在2.0%以内即可。,高效液相色谱法测定含量,(3)待全部样品检测结束后（无所谓n针，即便运转了一天、亦无须担忧），任取一份

13、对照溶液回进一针，计算含量（浓度），应在理论浓度偏差的2.0%以内，便可确保检测过程中仪器性能的稳定。(4)如原方法为内标法，秉承药审中心提出的“仿产品不是仿标准”理念，一定要改为外标法！除非前处理极为繁琐、较易损失时。,含量测定浓度和色谱条件如何建立浓度不要与有关物质浓度一致；一般为1/101/50。便于过滤（对于制剂）、杂质干扰减少、积分准确。色谱条件可与有关物质不一致（如有关物质为梯度洗脱或保留时间很长），更加科学化、人性化。波长不是最大吸收波长亦可、选用末端吸收。要注意样品粉末占有一定体积时引起的误差。,薄层色谱法测定有关物质,(1)尽可能使用商品化薄层板、不建议自行铺制。(2)设置梯

14、度对照(1.0%、0.5%、0.2%和0.1%，通过点样量来实现，方便快捷、事半功倍)；实现“半定量”。(3)0.1%斑点如显现不出，加大点样量。(4)主斑点如超载、“断腰”，可适当减小点样量。(5)显色剂尽可能新鲜配制。(6)观测时，建议增加翻转观测，即透过玻璃面观测。,高效液相色谱法测定有关物质,(1)每批样品配制1份，即可。(2)多批样品同时检测时，选用粉末量最少的样品稀释制成自身对照溶液即可，绝对无需每一样品均稀释成自身对照溶液。(3)对照溶液连续进样3针，计算主峰峰面积的RSD，小于2.0%即认为仪器稳定、积分无误。取峰面积均值用于样品杂质峰比较。,高效液相色谱法测定有关物质,(4)

15、测定空白溶剂（梯度洗脱时一定要先行测定）(5)每一样品进样一针，对杂质峰进行积分。积分时注意事项：最小峰面积：设定为对照溶液主峰面积的1/10-1/50（讲述原理）斜率与峰宽：与对照溶液积分参数相同。技巧：对照溶液稀释后，若主峰面积呈线性（一般均呈线性），归一化法计算结果与自身对照法测定结果基本一致（相差在0.02%以内），可用归一化直接观测。,方法学验证中各项指标的深度剖析,一、线性试验,主成分含量测定 以测定浓度为100%，50%120%之间选取5个点即可。溶出（释放）度测定 以释放量的10%120%间选取5个点即可。杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限度为100%，50%120%之间选

16、取5个点即可。,测定结果：1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。2）误差在哪里，应用时的注意事项。3）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、N结构，紫外监测器决定。个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会出现不成线性。4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的原理知晓。何种情况不呈线性？,唑 来 磷 酸 结 构 式,不呈线性情况：1）分子结构式怪异，如唑来膦酸。2）梯度洗脱，所以此时规定柱效无意义。3）主成分在色谱柱上几乎无保留，保留时间为“死时间”（如氢溴酸右美沙芬的测定）4）浓度过高时、检测器或色谱柱超载。,引申使用：1）有关物质测定 归一化法和自身对照法的相互妙用。2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓

17、度设定为中间浓度。举例说明。3）回收率试验为何做80%120%即可？亦及样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的理解。4）国内只注重相关系数，不注重截距。,二、精密度试验,重复性试验：连续进样6次。中间精密度试验和重现性试验通过“耐用性试验中的溶液稳定性试验”来体现。浓度极低时才会不理想，加大进样量。色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被测物质峰尽快出峰。,三、准确度试验 用回收率来衡量,作法：在80%120%间选择3点或5点，原因是由外标一点法决定的。已知杂质、且有杂质对照品的，可采用加入法，即加样回收率来评价。一般情况下，只要空白辅料无干扰，回收率均是良好

18、的！,四、专属性,有关物质为主，其他检测项目（含量）基本上均参照有关物质。有关物质的验证，采用中间体和降解产物（确认结构后人工合成）来验证与主成分的分离。详述强破坏试验的宗旨与内涵！,系统适用性试验用溶液配制法 在100浓度的主成分溶液中加入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中有可能存在的状态。介绍配制方法：先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓的对照品溶液）来稀释，简便、易行！存在问题：配制相同浓度，测定样品时，主成分峰骤然加大，将杂质峰覆盖。,专属性试验验证图谱,强破坏试验的目的 验证药品在遭遇了极端的气候环境条件下产生的杂质，在所建立的色谱条件下是否能够分离、测定。破坏追求的目标：可产生降

19、解产物的条件下，主成分保留7080%量。同时采用DAD 检测主峰纯度，验证其中不含杂质峰。保留时间的设定 经过上述方法学认证后，确定供试品溶液的保留时间，通常以洗脱出全部杂质和经强力破坏试验出的杂质，规定至主成分保留时间的几倍为止。,强力破坏试验（世界卫生组织公布的最新方法）热破坏 取原料，加溶剂配成1:1溶液后，在60放置 110天。高湿破坏 取原料固体适量，放置在75%湿度下110天。强酸破坏 取原料适量，用0.1mol/L盐酸溶液配制成2:1 溶液后，放置1-10天。强碱破坏 取原料适量，用0.1mol/L氢氧化钠溶液配制成 2:1溶液后，放置1-10天。氧化破坏 取原料适量，用3%过氧

20、化氢溶液配制成1:1溶 液后，放置1-3天。光解破坏 取原料适量，置紫外灯下放置1-10天。金属离子破坏 加入0.05mol/LFe2+或Cu2+。,四、检测限,信噪比的三倍 纯属“纸上谈兵”，实际测定中根本用不上。是相对值，不是绝对值。是相对于供试品溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。,(1)最大进样量(2)有关物质测定供试品溶液浓度、(3)含量测定浓度(4)有关物质测定自身稀释对照溶液浓度(5)最低检出限 五者间的比例关系,检测波长的确定与杂质校正因子的引入,原理：通常选取主成分最大吸收波长。该波长下，由 于各物质结构式不同，当用峰面积表达含量或浓度时 会有偏差，故必须验

21、证各杂质的响应校正因子。验证法：取已知纯度系数的杂质对照品（无需很纯）与主成分对照品，均配制成1.0%浓度的混合对照溶 液，连续进样6针，取平均峰面积计算校正因子。质量标准中拟定法：该杂质的定位强烈建议采用固定 型号与规格的色谱柱（即研究用色谱柱）进行，杂质 含量引入校正因子即可。列举实例！,方法学认证中的耐受性试验 是指更换试验因素，如不同人员、不同仪器，不同色谱柱型号、厂家，不同试剂等因素。这一点才是真正至关重要的！认证时不可能面面俱到。通过质量标准中系统适用性来完成。申报资料中以溶液稳定性来作为该项验证的主要内容即可。,溶液稳定性的全面判定不能单从主成分入手！还要注意所有组分的百分比变化

22、，绝对值变化！,对照品的使用与管理,称量：固体/采用的称量纸一定要小，一般为购买来的硫酸纸1/4即可。如称过量，可取回。液体/采用倒称法，将吸管或药勺同对照品一并称量。对于价格昂贵或量极少的对照品，可考虑将配制好的对照品溶液贮藏于冰箱内放置，在一定时间内使用。但该时间段必须经过验证。,对照品溶液贮藏时间验证方法,0天配制时，取浓度高的溶液（最好不低于有关物质测定时的供试品溶液浓度）进样测定，观测杂质与主成分情况（用归一化法）。每隔一段时间再取浓度高的溶液测定，依法观察。在三或六个月节点，另配制一份对照品溶液，测定前两份对照品含量，如在2.0%以内，则证明对照品溶液浓度没有改变，可在该时间段内使

23、用。,质量标准中制订有关物质的原则 原料药必须拟定，即便14号资料稳定性考核结果极其良好，杂质没有任何变化。固体制剂酌情拟定、重点关注降解杂质。如果原料制成制剂和制剂有效期内杂质没有增加，即可不制订。注射剂迫于目前形势，一定要拟定！即便14号资料中杂质没有任何变化、也要拟定！否则极易被“发补”。,质量标准中的系统适用性试验如何拟定 柱效2500即可，没必要更高，否则作茧自缚。采用杂质对照品验证分离度，如该杂质仅用于定位、则无需纯度很高；该杂质的选择一者可为目标降解物，分离度要求根据研究时的具体情况拟定；二者选用与主成分峰最难分离杂质。采用强破坏试验验证，通过对比破坏前产生的杂质峰与主成分峰的分

24、离情况。,质量标准中的系统适用性试验如何拟定 如：国家药品标准WS1-(X-350)-2004Z注射用奥美拉唑钠的质量标准中规定：取供试品溶液，加3%过氧化氢溶液3ml，放置10分钟后，再加流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性验证用溶液。色谱图中与主成分峰相邻的氧化降解产物峰与主成分峰的分离度应符合规定。,典 型 图 谱 分 析,复方制剂杂质制订原则与技巧 切勿采用自身对照法、用对照溶液主成分峰面积和与供试品溶液中杂质峰面积和进行比较，因无法进行杂质准确归属，导致误判。通过查询各组分单方制剂质量标准，知晓目标降解杂质，如氢氯噻嗪。重点关注降解杂质，通过 14号稳定性考核资料得以知晓。质量标准

25、中最好采用杂质对照品法予以定量测定，或针对主成分归属、采用自身对照法（有时需加入校正因子）。14号稳定性考核资料中未有变化的杂质或杂质谱通过各时间段图谱的比较说明，以及与参比制剂图谱的比较说明，质量标准可不拟定。,制剂检测时如有辅料峰存在如何处理？辅料峰保留时间均较短，如在溶剂峰前，可在质量标准中规定：“扣除溶剂峰与溶剂峰前的辅料峰”。如辅料峰在溶剂峰后、但也较为靠前，在第一个杂质峰前，可通过设定“扣除主峰保留时间X倍前的辅料峰”。“X倍”的确定一者建议至少测试市场上3个主流品牌；二者在质量标准中指定色谱柱具体型号与规格（推荐后者）。如辅料峰夹杂在各峰间。探明为何辅料后，质量标准中如下拟定：取

26、X辅料适量，用溶剂配制成一定浓度后进样测定，供试品溶液中扣除该峰。,分析人员工作的最高境界,分析人员的最高境界不是做得越多越好，而是采用最少的人力、物力和财力获得的数据在工作要求的误差范围内即可，即“事半功倍”之效。,新药申报资料中的注意事项(1)首要时清晰、明了。代表了一个企业技术水准与形象。(2)为他人着想，是给评审老师看的，不是给自己看的。现在药检所和审评中心将有时间和精力来看了。(3)10号资料中关键图谱一定要附上。含量测定、有关物质、溶出度紫外扫描图谱等、参考文献等。(4)11号资料中的参考文献，起草说明，一定要详细阐述。文字撰写一定要清楚，不要怕写得多，要清楚详细，让他人一幕了然、

27、清晰明了。(5)12号资料中的具体数值。(6)14号资料中，需检测的项目不要遗漏调，不同的剂型一定要深入研究。,作为企业的思考！如何从全国众多的仿制药企业中脱颖而出？市场销售的切入点？是以价格取胜，还是以技术取胜？（与其他各厂家产品的比较）介绍以色列和印度的作法；扎扎实实地做好仿制药、做好“普药”！（国内有厂家在进行中）,对于企业界寄语（如何脱颖而出？）第一步：每一产品/剂型皆有其核心与灵魂性评价指标。企业可通过对比现行国内质量标准中这些指标与国外同品种质量标准找到差距，且必须购买来原研产品，针对以上各关键性评价指标进行对比研究，发现自身产品内在品质上存在的不足，随后有的放矢地进行“二次开发”

28、，重新研究制剂工艺/处方筛选等，力争研制生产出与原研品相同内在品质的自身仿制产品来。,对于企业界寄语（如何脱颖而出？）第二步：提高质量标准，彰显“与众不同“。列举如下：(1)针对固体制剂的有效性即生物利用度。测定两者产品在各 pH值溶出介质中的溶出曲线，彰显内在品质！(2)针对液体制剂安全性杂质控制，增加已知杂质、单个未知杂质、总杂质控制，且限度依照参比制剂拟定。(3)针对难溶性软膏剂型的有效性、增加粒度控制。,对于企业界寄语（如何脱颖而出？）(4)针对注射用粉末剂型的有效性，增加粒度分布、晶型、比表面能、粒子形状、晶格能等物理化学参数的评估（国产注射用头孢曲松钠与原研品“罗氏芬”在临床疗效上

29、的差距便可在以上评价指标中得以体现）(5)对于重（装）量差异，不采用中国药典规定（其只有精密度、没有准确度要求，故可放心大胆地进行“底限投料”！），而采用国外药典的类似于“含量均匀度检查法”的评判标准，生产出品质更加均一、含量更为靠近标示值(100%)的产品。,对于企业界寄语（如何脱颖而出？）第三步：向国家新药审评中心或药典会提出补充申请，同时递交更新的质量标准，其中的关键指标上皆要高于现行标准。第四步：凭借质量标准上的优势，在市场推广和技术营销上“做足文章”，进而寻求在各处招标定价上的优势。现今、一些国内合资药厂和进口仿制药厂纷纷采取此种方式。,对于企业界寄语（如何脱颖而出？）第五步：申请发改委“差别定价”！2009年8月10日、国家发改委已率先在广东的“药品招标”中引入了“差别定价政策”，拟定了三大类、11小类产品可提出申请！其中：获得国家级资质机构认定其药品有效性、安全性、质量可控性明显优于其他企业同品种剂型药品的；获得国家药品审评等资质机构认定该药品注册标准指标明显优于同类其它品种的。获得国际认证并能够出口的药品制剂。现阶段暂考虑国内加工生产并能够出口到欧盟、美国、日本或澳大利亚市场，且连续出口超过2年。,对于企业界的寄语（穷则独善其身）希望在座“有想法的”企业 能够励精图治、做出物美价廉的有效药！这才是企业发展的王道！,期待着与您的进一步交流！（谢 沐 风）,