基因芯片的操作流程及步骤.ppt

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1、,1 CELL=23 PAIRS OF CHROMOSOMES,23 PAIRS OF CHROMOSOMES=3,200,000,000 BASES,1 HUMAN BODY=100,000,000,000,000 CELLS,基因芯片结构示意图,生物芯片的制作步骤,细胞,对mRNA进行标记,杂交,基因表达资料,基因芯片研制的总体蓝图,研制方向的确定,基因组序列分析与待检基因探针序列的确定,检测样品 的制备,探针阵列的准备,检测设备的研制,杂交检测与数据分析,简介,基因芯片探针固相原位合成技术与照相平板印刷技术激光共聚焦显微技术,大量探针分子（通常每平方厘米点阵密度高于500）,于固定支持物

2、上,检测每个探针分子的杂交信号强度,与被标记的样品分子进行杂交,获取样品分子的数量和序列信息,一次性对样品大量序列进行检测和分析，解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting和Northern Blotting等）技术操作繁杂、自动化程序低、操作序列数量少、检测效率低等不足。,基因芯片是信息时代的产物,横跨：生命科学、物理学、计算机科学、微电子技术光电技术、材料科学 等现代高科技。,中科院遗传所人类基因组中心北京大学联合基因集团有限公司我国第一家批量生产基因 芯片拥有近2千条基因药物发明专利东南大学吴健雄实验室中科院计算所生物信息学实验室上海生科院,4.我国主要研究单位,我国基因

3、芯片的研究现状,目前，我国尚未有较成型的基因芯片问世，但据悉已有几家单位组织人力物力从事该技术的研制工作，并取得了一些可喜的进展。标志着我国相关学科与技术正在走向成熟。涉及领域：生命科学、计算机科学、精密机械科学,生物芯片分类,根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。,6400点的基因芯片（面积 12X14 mm),基因芯片（gene chip）的原理,基因芯片的测序原理是杂交测序法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中

4、带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶序列的核酸。,基因芯片又称DNA微阵列（DNAmicroarray）,三种主要类型：1）固定在聚合物基片（尼龙膜、硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段通过同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列与荧光标记的靶基因杂交进行检测,把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大

5、量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。,基因芯片原型,主要类型,多种方法将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上原位合成（in situ synthesis）合成点样支持物：玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等,薄膜型、玻片型,微板型,集成电路型,基因芯片/DNA 微阵列Gene Chip/DNA Microarray,核酸杂交技术是基因芯片应用的基础。,第二节、基因芯片技术,核酸体外杂交技术,表达型基因芯片的设计,一、基因芯片（DNA微阵列）,寡核苷酸芯片、cDNA芯片、Genomic芯片 模式一：是将靶DNA固定于支持物上，适 合于大量不同靶DNA的分析，模式二

6、：将大量探针分子固定于支持物上，适合对同一靶DNA进行不同探针序列的分 析。,1.基因芯片原理,基因芯片是在基因探针的基础上研制出的。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。基因芯片技术是建立在Southern blot基础之上的，可以说它是Southern blot的改进和发展，它的原理是：变性DNA 加入探针后在一定温度下退火，同源片段之间通过碱基互补形成双链杂交分子。,2.基因芯片的基本原理分析,任何线状

7、的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列：,这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算

8、机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。,原理-通过杂交检测信息,一组寡核苷酸探针,TATGCAATCTAG,CGTTAGAT,ACGTTAGA,ATACGTTAGATC,TACGTTAG,由杂交位置确定的一组,核酸探针序列,GTTAGATC,杂交探针组,TATGCAATCTAG,重组的互补序列,靶序列,TACGTTAG,ACGTTAGA,ATACGTTA,CGTTAGAT,GTTAGATC,ATACGTTA,基因芯片,荧光标记的样品,共聚焦显微镜,获取荧光图象,杂交结果分析,探 针 设 计,杂交,PCR扩增靶基因标记,表达差异分析多态性分析再测

9、序,生物信息学数学优化数据库,基因芯片的相关技术示意图,二、基因芯片基本操作流程,制备总RNA mRNA经RT-PCR用Cy3（正常对照组）和Cy5（实验组）荧光标记目的基因，得到cDNA 探针 混合标记探针与表达谱芯片上核苷酸片段（或基因）杂交扫描分析杂交结果结论载体+寡核苷酸-探针分子+荧光染料-点样仪-扫描仪-计算机+专业软件,基 因 芯 片 流 程,样品制备,芯片制备,杂交,杂交信号检测,数据分析,基因芯片的操作流程,基因芯片流程（一）,1.实验设计2.样品制备（指mRNA或总RNA样品，包括对照组和实验组。将mRNA或总RNA分别进行逆转录生成cDNA，然后将对照组和实验组cDNA分

10、别标记Cy3和Cy5荧光信号）3.芯片制备（寡核苷酸探针或 cDNA探针，包括PCR，纯化，点样等步骤）,例 基于芯片的基因测序,基因芯片流程（二）,4.芯片杂交（将用Cy3和Cy5荧光标记的对照组和实验组的cDNA 等量混合，与芯片进行杂交）5.芯片扫描（采用激光扫描仪，分别用532nm和635nm波长激光扫描芯片，对于每张芯片，得到Cy3和Cy5通道两幅图象）,cDNA spotted microarrays,基因芯片流程（三）,6.图象处理（采用专门软件，对图象进行分析，提取每个点上的数字信号，得到原始数据表）7.数据校正和筛选（对Cy5或Cy3信号进行校正，消除实验或扫描等各环节因素对

11、数据的影响，同时利用筛选规则对数据中的“坏点”，“小点”，“低信号点”进行筛选，并作标记）,基因芯片流程（四）,8.目的基因或序列的确定（采用ratio值对差异基因进行判断，或采用统计方法如线性回归、主成分分析、调整P值算法等对差异基因进行统计推断）9.生物信息学分析（如cluster 算法、差异基因的同源性比对，差异基因的相关文献检索等）,微流控芯片检测仪,基因芯片的阅读分析系统,芯片扫描仪,芯片杂交盒,三、基因芯片设计步骤,1.基因芯片设计的一般性原则基因芯片设计主要包括两个方面:探针的设计指如何选择芯片上的探针探针在芯片上的布局指如何将探针排布在芯片上。,确定芯片所要检测的目标对象查询生

12、物分子数据库取得相应的DNA序列数据 序列对比分析找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。数据库搜索得到关于序列突变的信息及其它信息。,在进行探针设计和布局时必须考虑以下几个方面：(1)互补性(2)敏感性和特异性(3)容错性(4)可靠性(5)可控性(6)可读性,基因芯片使用步骤,芯片制作,把探针固定于载体表面,样品处理,目标分子富集,分子间的杂交,结果检测与数据分析,基因芯片的制作方式,原位合成,直接点样,原位光蚀刻合成,原位喷印合成,分子印章法,针式点样,喷墨点样,光导原位合成法,原位合成法,主要为光引导聚合技术（Light-directed synthesis），不仅可用于寡核苷酸的合成，也

13、可用于合成寡肽分子。主要步骤为：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。,优点是可以用很少的步骤合成及其大量的探针阵列,1、原位光蚀刻合成,寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由Affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多

14、种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536个探针。,目前美国Affymetrix公司已有同时检测6,500个已知人类基因的DNA芯片，并且正在制备含500,000-1,000,000个寡核苷酸探针的人类基因检测芯片。该公司每月投入基因芯片研究的经费约100万美元。该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊断等，而且在大规模药物开发方面也具有诱人的前景。目前，用于分子诊断的DNA芯片不仅已可用于检测爱滋病病毒基因还可用于囊性

15、纤维化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相关基因的基因诊断。鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成本高及合成效率不高的问题，因此有待进行以下研究：对光刻技术进行改进，提高合成效率；开发新的原位合成技术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。,2、光导原位合成法,是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographic mask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定

16、，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N个核苷酸长的芯片需要4N个步骤。每一个独特序列的探针称为一个“feature”，这样的芯片便具有4N个“feature”，包含了全部长度为N的核苷酸序列。这种原位直接合成的方法无须制备处理克隆和PCR产物，但是每轮反应所需设计的光栅则是主要的经费消耗。运用这种方法制作的芯片密度可高达106探针/平方厘米，即探针间隔为 510m，但只能制作II型 DNA芯片。,3、原位喷印合成,芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳

17、粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不特殊制备的化学试剂。,4、点样法,点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片，经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子，点样量很小，约为5nl。大规模CDNA芯

18、片多采用这种方法，与其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潜在优越性是具有更强的亲和势和特异性杂交，但是需要大量制备，纯化，量化，分类PCR产物。,玻璃片基的处理：使玻璃表面获得羟基、醛基、氨基等活性基团。点样针沾取探针溶液。点样针把探针点到玻片表面，让探针末端的化学集团与玻片表面的集团形成共价键。针式点样的优缺点优点：成本低，操作简单，密度高（几千-几十万点/cm2)，转移过程中探针溶液损失小。缺点：定量准确性、重现性不好,5.针式点样,生产商 Bio-Rad性能介绍 分辨率：1.25um(x，y轴)和0.25um(Z轴)，重复性：3um 球面精确性：l0um。一次制成芯片数：126块芯片 每块

19、玻片点样量82,000个点,2202芯片点样仪,喷墨点样的方式类似于喷墨打印机。将合成用探针溶液放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的探针试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。,6.喷墨点样,7.分子印章法,根据阵列合成的要求设计并制作表面凹凸不平的分子印章，再按照合成的顺序，将寡核苷酸合成试剂涂布在不同的印章上，逐个依次压印到芯片特定位点进行合成反应。合成的后续反应与压电打印类似。分子印章法不仅可用于制备原位合成芯片，还可用于DNA微集阵列的制作。,1样品制备

20、。,一般所需mRNA的量是以一张表达谱芯片需要3g mRNA计算的,2 样本采集过程关键点,氰代磷酸二乙酯(DEPC),离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，剔除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜；肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净）。在RNase-Free 0.9生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。用铝箔包裹组织，或用5ml冻存管装载组织(但最好统一采用铝箔)。用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入液氮冷却。填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等将液氮冷却的组织放入样品

21、袋（每个样品袋只保存同样的组织），袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸（标签上注明：样品名称、编号、日期），迅速转入便携式液氮罐保留1-2张取材部位的病理切片。,以上步骤应在冰上进行且不超过15分钟，超过时间会导致样品的RNA降解。对肿瘤组织的取材，要求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，例如对于手术切除的整个或部分前列腺，可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。,待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。当然，常规的基因分离、扩增及标记技术完全可以采用，但操作繁琐且费时。高度集成的

22、微型样品处理系统如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和发展方向。为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。,杂交条件的选择与研究目的有关，多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。通常设计出一套四种寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严

23、谨程度，即可测定出该碱基的种类。如果芯片仅用于检测基因表达，只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核苷酸即可。表达检测需要长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。,杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部分。由于DNA芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模DNA芯片由于其面积小，密度大，点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupled device camera，CCD)摄像机等弱光

24、信号探测装置。此外，大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。,1荧光标记杂交信号的检测方法2生物素标记方法中的杂交信号探测,1荧光标记杂交信号的检测方法,（1）激光扫描荧光显微镜探测装置比较典型。方法是将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为510m。同时通过同一物镜收集荧光

25、信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制传动平台XY方向上步进平移，DNA芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成20m象素的图像。这种方法分辨率高、图像质量较好，适用于各种主要类型的DNA芯片及大规模DNA芯片杂交信号检测，广泛应用于基因表达、基因诊断等方面研究。,(2)激光扫描共焦显微镜,激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似，但是由于采用了共焦技术因而更具优越性。这种方法可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测，而无须清洗掉未杂交分子，从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。通

26、过计算机控制激光束或样品池的移动，便可实现对芯片的二维扫描，移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配，在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。其特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用。现在 Affymetrix公司已推出商业化样机，整套系统约 12万美元。,（3）采用了CCD相机的荧光显微镜,这种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微镜，但是以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍增管，因而无须扫描传动平台。由于采用了CCD相机，因而大大提高了获取荧光图像的速度，曝光时间可缩短至零点几秒至十几秒。其特点是扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用,（4）光纤传感器,将

27、 DNA芯片直接做在光纤维束的切面上（远端），光纤维束的另一端（近端）经特制的耦合装置耦合到荧光显微镜中。光纤维束由7根单模光纤组成。每根光纤的直径为200m，两端均经化学方法抛光清洁。化学方法合成的寡核苷酸探针共价结合于每根光纤的远端组成寡核苷酸阵列。将光纤远端浸入到荧光标记的靶分子溶液中与靶分子杂交，通过光纤维束传导来自荧光显微镜的激光（490urn），激发荧光标记物产生荧光，仍用光纤维束传导荧光信号返回到荧光显微镜，由CCD相机接收。这种方法快速、便捷，可实时检测DNA微阵列杂交情况而且具有较高的灵敏度，但由于光纤维束所含光纤数目有限，因而不便于制备大规模DNA芯片，有一定的应用局限性。

28、,2生物素标记方法中的杂交信号探测,以生物素（biotin）标记样品的方法由来已久，通常都要联合使用其它大分子与抗生物素的结合物（如结合化学发光底物酶、荧光素等），再利用所结合大分子的特殊性质得到最初的杂交信号，由于所选用的与抗生物素结合的分子种类繁多，因而检测方法也更趋多样化。特别是如果采用尼龙膜作为固相支持物，直接以荧光标记的探针用于DNA芯片杂交将受到很大的限制，因为在尼龙膜上荧光标记信号信噪比较低。因而使用尼龙膜作为固相支持物的这些研究者大多是采用生物素标记的。目前应用较多的是美国General Scanning公司开发的基因芯片专用检测系统(ScanArray 3000)，采用激光共

29、聚焦扫描原理进行荧光信号采集，由计算机处理荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。近期又开发出了ScanArray 5000，其扫描精度和功能有较大的提高。,5.结果的分析,样品在被测定前，首先要经过消化，使待测组织细胞中的DNA或RNA释放出来，在经过适当的扩增后，以荧光标记物标记，放入基因芯片自动孵育装置中，由其自动控制反应的时间、温度以及缓冲液的配比等反应条件，进行杂交。杂交完成后，要对基因芯片进行“读片”，即应用激光共聚焦荧光扫描显微镜，对基因芯片表面的每个位点进行检测。检测结合到芯片表面位点的样品片断的荧光标记，而待测样品中未与芯片上探针结合的荧光标记物，则悬浮于溶液中，由于

30、不在聚焦平面上，因而不被检测。样品与探针的错配是影响杂交反应结果的重要因素，但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错配时强的多，因此，通过对信号强度的分析，就可以区分正确与错误的配对。,为了使结果的检验更加简便和快速，Affymetrix的基因芯片的分析系统中采用了基因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站，对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的分析，仅需要数分钟的时间。这样在短短的几十分钟至数小时内，就可以完成用传统方法需要数月才能完成的几万乃至几十万次杂交分析试验。,基因芯片作为生物芯片的代表，其发展目标同生物芯片的目标一样是“芯片实验室”(Lab-on-chip)，也即将整个生

31、化检测分析过程缩微到芯片上。“芯片实验室”通过微细加工工艺制作的微滤器、微反应器、微泵、微阀门、微电极等以实现对生物样品从制备、生化反应到检测和分析的全过程，而且实验过程趋于自动化从而极大地缩短的检测和分析时间，节省了实验材料，而且又降低人为主观因素，大大提高实验的客观性。,基因芯片技术发展到今天不过短短几年时间，虽然还存在这样或那样的问题，但其在基因表达谱分析、基因诊断、药物筛选及序列分析等诸多领域已呈现出广阔的应用前景，随着研究的不断深入和技术的更加完善基因芯片一定会在生命科学研究领域发挥出其非凡的作用。基因芯片最终的意义和目的不再于本身，而在于它极大地提高了人类认识生命本质的能力和手段，

32、为揭示人类这个复杂网络系统打下基础。从某种意义上我们可以这样认为：基因的结构或种类决定物种；基因的功能或表达则决定生命，即生物的生、老、病、死。基因芯片技术将为我们提供一条认识生命本质的捷径。当然基因芯片并非万能，基因的表达并非代表生命活动本质，生命执行者应是蛋白质，因而基因芯片必需同蛋白组学相关技术，如二维凝胶电泳、蛋白质芯片、大规模双杂交体系等相结合才有望真正揭示生命活动的时空过程。,技术操作简单 自动化程度高 序列数量大 检测效率高 应用范围广 成本相对低,基因芯片技术的主要特点,1、样品制备上 当前在标记和测定前都要对样品进行一定程度的扩增以便提高检测的灵敏度，但仍有不少人在尝试绕过该问题，这包括固相 PCR 扩增体系以及大量并行固相克隆方法，两种方法各有优缺点，但目前尚未取得实际应用。2、探针的合成与固定复杂 特别是对于制作高密度的探针阵列。使用光导聚合技术每步产率不高（95%），难于保证好的聚合效果。,当前面临的困难,3、目标分子的标记 这是一个重要的限速步骤，如何简化或绕过这一步现在仍然是个问题。4、目标分子与探针的杂交 由于杂交位于固相表面，所以有一定程度的空间阻碍作用，有必要设法减小这种不利因素的影响。5、信号的获取与分析上 当前多数方法使用荧光法进行检测和分析，重复性较好，但灵敏仍然不高。,