发酵工程第四章发酵工业的无菌技术.ppt

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1、4 发酵工业的无菌技术,4.1 发酵工业的无菌处理,灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。除菌(degermation):用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。防腐(antisepsis):用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。,控制有害微生物主要有以下几种措施：,杀灭病原微生物,杀灭一切微生物,4.2 发酵工业污染的防治策略,什么是染菌？发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖。,1）由于杂菌污染，使发酵培养基因杂菌的消耗而损失，造

2、成产率的下降；2）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后发酵液某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成得率降低或使产品质量下降；3）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；,4.2.1 杂菌污染的危害,4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化；5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败等。,染菌危害的具体分析（1）染菌对不同菌种发酵的影响,A细菌谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。,B.霉菌PenG：绝大多数

3、杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所获。柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。,链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养，干扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。,青霉素：怕染细短产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌柠檬酸：怕染青霉

4、菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染,C.酵母菌:易污染细菌以及野生酵母菌 D.疫苗生产:危害很大,现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。,污染其它杂菌有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。,由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养基营养丰富

5、，容易污染杂菌。种子染菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌，如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。,（2）不同发酵时期染菌对发酵的影响,1）种子培养期染菌,2）发酵前期染菌,发酵前期最易染菌。原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。措施 如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。,发酵中期染菌，处理困难，危害很大。,3）发酵中期染菌,发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使

6、已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。,4）发酵后期染菌,发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。,（3）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响,1）发酵染菌对过滤的影响,染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难。,污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如污染霉菌时，影

7、响较小，而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率，直接影响提取总收率。,丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难 预处理方法：将发酵液加热后再加助滤剂；先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化,染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺

8、，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。,4.2.2 杂菌污染的防治1.染菌的检查与判断,显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断DO2水平异常变化pH异常变化尾气CO2异常变化,双层平板法,底层平板（2琼脂培养基10mL）,上层平板,上层培养基（1琼脂培养基5mL）,宿主菌悬液（对数期菌液0.2mL）,噬菌体试样（合适稀释液0.1mL）,混匀,

9、37,10余h,计数噬菌斑,溶解氧水平的异常变化感染噬菌体，生产菌的作用受到抑制，溶氧浓度很快上升。污染好氧性杂菌，溶解氧在短时间内下降，并接近零值，长时间不能回升；污染非好氧性杂菌，生产菌受到抑制，耗氧量减少，溶解氧升高。,1,2,尾气中CO2含量异常污染杂菌，糖耗加快，CO2含量增加；感染噬菌体，糖耗减慢，CO2含量减少。,pH异常对于污染产酸菌或利用碳源效率高生长较快的杂菌，会使pH迅速下降。,2.污染原因分析,主要原因：种子带菌 无菌空气带菌 设备渗漏 灭菌不彻底 操作失误 技术管理不善,日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析 项目 百分率%种子带菌或怀疑种子带菌 9.6

10、4接种时罐压跌零 0.19培养基灭菌不透 0.79总空气系统有菌 19.96泡沫冒顶 0.48夹套穿孔 12.36盘管穿孔 5.89接种管穿孔 0.39阀门渗漏 1.45搅拌轴密封渗漏 2.09罐盖漏 1.54其它设备渗漏 10.13操作原因 10.15 原因不明 24.94,1）从污染杂菌的种类分析污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底；污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、设备渗漏或操作问题；污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。,2）从污染时间分析发酵前期染菌：种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、操作不当或空气带菌；

11、发酵后期染菌：中间补料污染、设备渗漏或操作问题。3）从染菌程度分析多个罐染菌：种子带菌、空气系统问题；个别罐染菌：设备问题、操作不当。,3.预防,（1）种子带菌及其防治发酵前期种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。,培养基及器具彻底灭菌灭菌锅使用避免菌种在移接过程中受污染无菌室避免菌种在培养过程或保藏过程中受杂菌污染,无菌室要求,在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种。用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、拖地.接种时必须在超净台上操作，超净台装有一台鼓

12、风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入接种区域，保证无菌条件。接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干净。,（2）过滤空气带菌及其防治,从日本工业技术院分析空气带菌而造成的染菌为19.96。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，不慎便会导致空气除菌失败。,正确选择采气口保持过滤介质的干燥设计和安装合理的空气过滤器,（3）设备渗漏或“死角”,设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析

13、发现，这类染菌占33.85。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。,密闭式发酵罐,2、机械搅拌发酵罐的结构,好气性机械搅拌发酵罐是密封式受压设备，主要部件包括：罐身轴封消泡器搅拌器联轴器中间轴承挡板空气分布管换热装置人孔以及管路等,“死角”,发酵罐的“死角”法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀管道安装不当或配置不合理形成的“死角”,灭菌时蒸汽不易通达的“死

14、角”及其消除方法,发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”,法兰连接不当造成的“死角”,（4）灭菌不彻底,灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系升温快慢、保温时间,泡沫蒸汽总压是否达到要求标准环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将连续灭菌预热至80的培养基采样培养，可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则仅发现23个芽孢杆菌。,培养基与设备灭菌不彻底的防治原料性状：大颗粒的原料过筛除去实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶连消不彻底：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角 操作不当造成染菌 噬菌

15、体染菌及其防治,4.3 发酵工业的无菌技术灭菌方法,干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法过滤除菌法火焰灭菌法,1）化学试剂灭菌法：常用试剂有甲醛、氯气（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）、臭氧等。这些物质易与微生物细胞中的一些成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性而杀灭微生物。由于化学试剂也会与培养基中的一些成分作用，而且加入培养基后不易去除，它不能用于培养基的灭菌，但染菌后的培养基可用化学药剂处理。,2）辐射灭菌：利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。如紫外线（穿透力低，仅适用于表面消毒和空气消毒）与菌体核酸的光化学反应而使菌体死

16、亡；的X射线、Co60产生的射线，它们含极高的能量，可使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OH-、H2O2和有机过氧化物，从而在微生物体内引起氧化连锁反应，导致微生物菌体迅速死亡。近年兴起了微波灭菌。,3）过滤除菌法适用于澄清液体和气体的除菌。是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。,4）干热灭菌法160下保温1-2h。干热对微生物有氧化、使细胞蛋白质变性和电解质浓缩等效应而使菌体死亡。5）火焰灭菌法灭菌彻底，但仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。,6）湿热灭菌法：湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这一方

17、面是由于湿热易于传递热量，蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。一般的湿热灭菌条件：121，30min。,高压蒸汽灭菌是发酵工业最常用的方法，能有效地杀灭杂菌，但高温也破坏培养基的营养成分。,消除高温有害影响的措施,（1）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（2）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；,（3）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112即0.

18、57kgcm2或8磅英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌；（4）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌。,7)间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在80100下蒸煮1560min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。,4.4 发酵培养基及设备管道灭菌,热死时间-衡量湿热灭菌的指标是指在规定的温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。,湿热灭菌的原理,1 微生物的热阻

19、杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。,各种微生物对湿热的相对热阻,2.微生物热死定律对数残留定律,实验证明，在一定温度下，微生物营养细胞的均相热死动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。,式中，N：任一时刻的活细菌浓度（个/L）;t：时间（min）;

20、K：比热死速率常数（min-1）.,若开始灭菌（t=0）时，培养基中活的微生物数为N0,t=2.303 logN0/N/k,-dN/dt=N,lnN/N0=-t,积分,2.303logN0/N=t,or,可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数N）和k值,例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每ml有2105个耐热细菌芽孢，121时灭菌速度常数为1.8min1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。,大肠杆菌在不同温度下的残留曲线,嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线,当Nt=0时，t=，既无意义，也不可能。一般采用Nt=0.001

21、，即1000次灭菌中只有一次失败。,实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。,2 灭菌温度和时间的选择,培养物质受热破坏也可看作一级反应：式中C：对热不稳定物质的浓度；k：分解速度常数；k的变化也遵循阿累尼乌斯方程：,都与相应的活化能及T有关,当T1 T2(k2/k1)/(k2/k1)=E/E1(EE)随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌。,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子

22、死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响。,3.影响培养基灭菌的其它因素,培养基成分油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。,pH：，微生物最耐热；pH6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。,温度 孢子数 灭菌时间(min)()(个/ml)pH=6.1 5.3 5.0 4.7 4.5120 10000 8 7 5 3 3 115 10000 25 25 16 13 13

23、110 10000 70 65 35 30 24100 10000 740 720 180 150 150,pH对灭菌时间的影响,培养基中的颗粒物质 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。,泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂。微生物数量：浓度越高，所需灭菌时间越长,例如：如肉毒梭状芽孢杆菌，在105湿热灭菌时芽孢杆菌数/ml 时间(min)9108 489106 369104 209102 14,分批灭菌,培养基的分批灭菌就是将配制好的

24、培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。在工业上，培养基的分批灭菌无需专门的灭菌设备，设备投资少，灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽要求低（表压），但因其灭菌温度低、时间长而对培养基成分破坏大，对操作难于实现自动控制。,培养基分批灭菌过程中的温度变化情况,过程包括：升温、保温和冷却三阶段。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%。,分批灭菌方法（实验室种子培养基）,手提式灭菌锅结构示意图,立式,台式,卧式,操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。冷却保压：把培养基的温度降低到接种

25、的温度。,分空气过滤器灭菌并用空气吹干,1）培养基的预热灭菌时培养基需通过夹套或蛇管先加热到8090，然后再导入蒸汽升温至120130。预热的目的一是防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温差过大而产生大量冷凝水使培养基稀释；二是防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起物料外溢。,2）培养基灭菌将蒸汽从进气口、排料口或取样口直接导入罐内，使罐温上升至120130，并保温30min。3）降温关闭蒸汽，通冷却水进行冷却，当罐内温度降至70以下时，启动搅拌桨搅拌，慢速搅动培养基，加速冷却。,当蒸汽阀门关闭以及通冷却水后，发酵罐的罐压将迅速下降，当罐内压力降至0.03MPa时，必须间隙开启进气阀，让无

26、菌空气进入发酵罐内，并使罐压保持在0.03-0.05 MPa之间，维持降温过程中的正压。应该指出，在分批灭菌时，升温阶段对灭菌亦是有贡献的。,温度随灭菌时间的变化,升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式(N/N0)=-kt 来粗略估算灭菌所需时间。,2.灭菌时间的估算,保证间歇灭菌成功的要素（1）内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象（2）压力稳定的蒸汽（3）合理的操作方法。,培养基的连续灭菌,连续灭菌就是将配制好的培养基在通入发酵罐时同时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。连续灭菌时，培养基在短时间内被

27、加热到灭菌温度（一般为130-140），短时间保温（一般为5-8min）后，被快速冷却，再进入早已灭菌完毕的发酵罐。组成培养基的不同成分（耐热与不耐热、糖与氮源）可在不同温度下分开灭菌，以减少培养基受热破坏的程度。,培养基的连续灭菌具有对培养基破坏小、可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量平稳等优点而被广泛应用，尤其在培养基体积较大时。但对加热蒸汽的压力要求较高，一般不小于0.45Mpa。同时连续灭菌需要一组附加设备，设备投资大。,连续灭菌（连消）,工艺流程喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程 灭菌时间的计算(Ct/C0)=kt t=2.303/klg

28、(C0/Ct)式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。,预热至60-70,132,40-50,维持数分钟,喷淋冷却连续灭菌流程,例2某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。,连续灭菌时间的估算,解：C0=2105(个/ml)Ct=0.001/(40106)=2.510-11(个/ml)t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11)=2.37 min,连续灭菌的优点：（适用于大型罐）可采用高温短时灭菌，

29、营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小；可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。,缺点：对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；蒸汽波动时灭菌不彻底；当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。,分批灭菌与连续灭菌的比较,灭菌方式,优点,缺点,连续灭菌,1,、灭菌温度高，可减少培养基中营养物,质的损失；,2,、操作条件恒定，灭菌质量稳定；,3,、易于实现管道化和自控操作；,4,、避免了反复的加热和冷却，提高了热,的利用率；,5,、发酵设备利用率高；,

30、1,、对设备的要求高，需另外设置加热冷却,装置；,2,、操作较麻烦；,3,、染菌的机会多；,4,、不适合于含大量固体物料的灭菌；,5,、对蒸汽的要求高；,分,批,灭菌,1,、设备要求低，不需另外的加热冷却装,置；,2,、,操作要求低，适于手动操作；,3,、适合于小批量生产规模；,4,、适合于含有大量固体物质的培养基的,灭菌；,1,、培养基的营养物质损失较多，灭菌后培,养基的质量下降；,2,、需进行反复的加热和冷却，能耗较高；,3,、不适合于大规模生产过程的灭菌；,4,、发酵罐的利用率较低；,发酵培养基及设备管道灭菌技术,空消及管道灭菌空气过滤器灭菌种子培养基实消发酵培养基实消发酵培养基连续灭菌

31、补料实罐灭菌,空气除菌,好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要作到绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济的。发酵对无菌空气的要求是：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标；发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌而造成损失即可。在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3,1、空气除菌的方法：辐射杀菌：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。加热杀菌：基于加热后微生物体内的蛋白质（酶）热变性而得以实现。静电除菌：利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。过滤除菌：利用微生物不能透过滤

32、膜除菌。,2、过滤除菌,过滤除菌是采用定期灭菌的介质（棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机或无机烧结材料）来截留空气中的微生物而制得无菌压缩空气。从可靠性，经济适用与便于控制等方面考虑，目前仍以介质过滤法较好，也是大多数发酵厂广泛采用的方法。,按过滤机制的不同,绝对过滤 利用微孔滤膜，其孔隙小于0.5甚至0.1m，将空气中的细菌滤除，从而获得无菌空气。,深层介质过滤 由多种介质组成过滤层，滤层较深，空隙较大，靠静电、扩散、惯性和阻截作用等将细菌截留在滤层中，从而获得无菌空气。,空气过滤介质,棉花玻璃纤维活性炭 超细玻璃纤维纸 石棉滤板 烧结材料过滤介质 新型过滤介质,1.棉花：品种不同，

33、要求新鲜，纤维长而疏松，贮存时间长的话，纤维易断，易堵塞。2玻璃纤维：直径小，不易折断，过滤效果好。阻力损失小3活性炭：强度高，表面积大，空隙大，阻力小，只有棉花阻力的1/12。缺点：体积大，装填费时费力，松紧度不易掌握，空气压降大。,4超细玻璃纤维纸：超细玻璃纤维纸是上好的无碱玻璃，喷吹成丝状纤维，再以造纸法做成。该过滤为高气速过滤，气流速度越高，效率越高。但超细玻璃纤维纸强度小，易断，多用于过滤器。为了增加强度，可添加：木浆纤维。但效率较低；环氧树脂；多层复合使用。可增加强度，厚度0.25mm。,5.石棉滤板：20石棉，80其它纤维，厚度35mm，纤维短，df粗，效率高。特点：不怕水，受潮

34、不易穿孔和折断。,过滤器的结构,（1）深层棉花（活性炭、玻璃纤维）过滤器,深层棉花过滤器是立式圆筒形，内部充填过滤介质，空气由下向上通过过滤介质，以达到除菌的目的。,填充物按下列顺序安装：金属丝网和麻布的作用是使空气均匀进入棉花滤层。在充填介质区间的过滤器圆筒外部有装夹套，作用为在消毒时对过滤介质加热，要十分小心控制，温度过高容易使棉花焦化而局部丧失过滤效率，甚至有烧焦着火的危险。空气一般从下部圆筒切线方向通入，从上部圆筒排出，出口不宜安装在顶盖，以免检修时拆装管道困难。,孔板铁丝网麻布棉花麻布活性炭麻布棉花麻布铁丝网孔板,过滤器上方装有安全阀、压力表，罐底装有排污孔，以便经常检查空气冷却是否

35、完全，过滤介质是否潮湿等情况。安装介质要求紧密均匀，压紧要一致。弹簧压紧装置可以保持在一定位移范围内对孔板的一定压力。,（2）平板式纤维纸分过滤器,空气从筒身中部切线方向进入，空气中的水雾沉入筒底，由排污管排出，空气经缓冲层通过下孔板经薄层介质过滤后，从上孔板进入顶盖排气孔排出。,金属丝网和麻布的作用仍是使空气均匀进入滤层。,（3）管式过滤器（4）接迭式低速过滤器,发酵生产中制备无菌空气的大致过程,空气除菌流程的分析,这是一个比较完善的空气除菌流程，可适应各种气候条件，能充分分离油水，使空气达到较低的相对适度下进入过滤器，以提高过滤效率。,两级冷却、加热除菌流程,特点：两次冷却、两次分离、适当

36、加热。,优点：能提高传热系数，节约冷却用水，油水分离得比较完全。,经第一冷却器冷却后，大部分的水、油都已结成较大的雾粒(20 m)，且雾粒浓度较大，故适宜用旋风分离器分离。第二冷却器使空气进一步冷却后析出较小雾粒(1 m)，宜采用丝网分离器分离，这样发挥丝网能够分离较小直径的雾粒和分离效率高的作用。通常，第一级冷却到3035，第二级冷却到2025。除水后，空气的相对湿度仍是100，须用丝网分离器后的加热器将空气中的相对湿度降低至5060，以保证过滤器的正常运行。尤其适用于潮湿地区，其他地区可根据当地的情况，对流程中的设备作适当的增减。,180M3发酵罐车间,大型空气压缩机,发酵车间的空气过滤器

37、,3 空气的预处理目的:提高压缩前空气的洁净度;去除压缩后空气中的油和水。,1）外源空气的前过程主要措施：提高空气吸气口的位置和加强吸入空气的前过滤。2）空气压缩及压缩空气的冷却空气经空压机压缩后，温度会显著上升，压缩比愈高，温度也愈高。,式中T1、T2压缩前后空气的热力学温度；p1、p2压缩前后空气的绝对压力；k绝热指数，空气为1.4。若压缩为多变过程，则可用多变指数m（对于空气）代替绝热指数。,若将高温压缩空气直接通入空气过滤器，压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧，而且增大发酵罐的降温负荷。增加培养液水分的蒸发 一般用列管式冷却器进行冷却。,粗过滤器,安装在压缩空气机前的过滤器，主

38、要作用是捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受磨损，同时也可减轻总过滤器负荷。要求过滤效率要高，阻力要小。通常有：布袋过滤，油浴洗涤和水雾除尘等。,空气贮罐消除压缩机排出空气量的脉冲，维持稳定的空气压力。利用重力沉降作用除去部分油雾。紧接空压机安装。有些装有冷却管。,3）.压缩空气的除油除水 冷却降温后的空气湿度增大，会使过滤介质受潮失效。,两类设备旋风分离器利用离心力进行沉降，对于10m以上的微粒分离效率较高。丝网分离器利用惯性进行拦截，分离效率较高，能除去25m的细小颗粒。,旋风分离器,采用惯性拦截等机理，有效去除空气中的水、油雾、尘埃，不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。,4）.空气的加热 将除油水

39、的空气加热（温差在1015C 左右），降低相对湿度（达50%60%）后，输入过滤器。用列管换热器。,4、空气过滤介质1）纤维状或颗粒状过滤介质：棉花、玻璃纤维、活性炭等。2）过滤纸类介质：主要是玻璃纤维纸。3）石棉滤板：20%蓝石棉和80%纸浆纤维混合打浆制成。4）烧结材料：烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料等。5）微孔滤膜类过滤介质,5、提高过滤除菌效率的措施1）减少进口空气的含菌数2）设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质3）设计合理的空气预处理设备，以达到除油、水和杂质的目的4）降低进入空气过滤器的空气的相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作5）稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐,