Sebia全自动凝胶电泳仪的临床应用.ppt

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1、Sebia 全自动凝胶电泳仪临床应用,襄阳市中心医院,使用范围和检测原理,电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小,形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离,鉴定或提纯的技术.在生化检测中,主要用于分离各类蛋白分子.,发展历程,1809年俄国科学家列伊斯首先发现电泳现象1937年瑞典科学家Tiselius建立了界面电泳技术,并首次证明了血清是由白蛋白及,球蛋白组成的因此获得1948年诺贝尔化学奖.1950年后,区带电泳从发展到成熟.1980年以来,毛细管电泳逐渐受到重视,常用的电泳技术,滤纸电泳醋酸纤维素薄膜电泳凝胶电泳琼脂糖凝

2、胶电泳:琼脂糖凝胶适用于蛋白质和核酸的电泳支持介质,成本低,结果易保存.聚丙烯酰胺凝胶电泳:最常用的定性分析蛋白质的电泳方法,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量,一般用于科研.毛细管电泳:经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物,血清蛋白电泳 免疫固定电泳非浓缩尿蛋白电泳,血清蛋白电泳,法国SEBIA 凝胶电泳,琼脂糖凝胶介质，分子筛效应，分辨率高不吸附蛋白质，阻力小，分离清晰，透明度高PH8.8碱性环境根据蛋白质所带电荷的多少和蛋白分子的大小及形状分离不同的蛋白成分按泳动速度分成5个区带（每个区带含1种或更多种的蛋白成分）,30人份琼脂糖凝胶片血清蛋白电泳,正常血清蛋白电泳图谱,血清蛋

3、白电泳的正常参考值,各区带构成,Alb：白蛋白 1：1酸性糖蛋白；1抗胰蛋白酶 1 脂蛋白;甲胎蛋白 2：HP；2巨球蛋白；脂蛋白；CER：转铁蛋白；补体系统；脂蛋白 纤维蛋白原；2微球蛋白：IgG；IgM；IgA；IgD；IgE CRP,血清蛋白电泳可以帮助我们精确地描绘出患者血清蛋白质的全貌，是生化仪测定蛋白质的完善和补充可以提示是哪一种球蛋白异常，便于临床有的放矢的进一步检查，节省患者费用,对单一克隆浆细胞异常增殖产生M蛋白的检测,血清蛋白电泳是其首选的实验诊断方法，由于MM髓外病灶在肝、脾、淋巴结多见，故认为肝功能异常患者应进行血清蛋白电泳检测作为筛选可帮助对一些遗传性疾病作出诊断，如

4、：双白蛋白血症、1抗胰蛋白酶缺陷，蛋白电泳呈现特征性图谱,血清蛋白电泳中发现的与急性时相反应蛋白相关的疾病,Alb 脱水 慢性消耗性疾病、慢性炎症、出血、烧伤、蛋白丢失、肠病、因白蛋白 减低而引起的肝脏功能下降、营养失调、肾病综合征、妊娠 1 妊娠 低抗胰蛋白酶血症 2 肾上腺不足、肾上腺皮质类固醇治疗、糖尿病、肾病综合征 营养不良、巨红细胞性贫血、蛋白丢失的肠病、严重肝病、Wilsons 病 胆汁硬化、癌症(有时)、Cushing s 病、糖尿病(某些病例)甲状腺机能减退、缺铁性贫血、恶性高血压、肾病、多动脉炎、阻塞 性黄疸、妊娠 营养不良 淀粉样变性、慢性感染、慢性淋巴细胞白血病、硬化、H

5、odgkins 疾 病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、结缔组织病、巨细胞血症 血中丙种球蛋白缺乏、低丙种球蛋白症,球蛋白区域的变化在肝病的临床意义,1球蛋白在肝炎初期，作为急性期反应物质常增加，而肝损害严重时则降低，在致命的肝功能衰竭时可以降低到很低的水平,球蛋白区域的变化在肝病的临床意义,2球蛋白的降低可能由于结合珠蛋白合成降低所致，但在胆汁淤积性肝炎时由于2脂蛋白增加可见到2球蛋白部位增加，当亚急性肝炎和肝坏死时，2球蛋白则明显减少，故2球蛋白的变化可作为肝障碍时的特征性指标，如明显下降，提示预后不良,球蛋白区域的变化在肝病的临床意义,球蛋白在肝炎早期几乎没有变化，但由于此组分也有脂蛋白，胆汁

6、淤积性肝炎时与2球蛋白一样，多数明显升高，当肝细胞损害严重时，由于肝脏合成减少则明显降低,球蛋白区域的变化在肝病的临床意义,几乎所有肝脏疾病球蛋白均升高，且呈多 株性的，其增加的范围与疾病的严重程度 相一致，若转为慢性可见球蛋白明显增高 这是由于免疫球蛋白合成亢进所致。,血清蛋白电泳图谱在肝脏疾病的变化,T-PROT Alb 1 2 肝炎 N 肝硬化 N N N-桥肝癌 N 甲胎蛋白 N N N,血清蛋白电泳图谱在肾病的改变,Alb明显降低，1-球蛋白轻度增加，2-球蛋白明显增加，-球蛋白降低、正常、增高，-球蛋白降低、正常 小儿类脂样肾病时，-球蛋白可降低，有时可降低至零 成人肾病综合症时，

7、-球蛋白通常增加，特别是狼疮性肾病。,肾病综合征,急性感染综合征,先天性白蛋白缺乏症,双白蛋白血症,1抗胰蛋白酶缺乏症,贫血之高转铁蛋白,免疫球蛋白增高,血清蛋白电泳是 M蛋白（Monoclonal Protein）多克隆（polyclonal Protein)寡克隆（Oligoclonal Protein)的首选检测项目,M蛋白疾病（Monoclonal gammap-athies,MG）是由于单一克隆浆细胞无限增殖产生的均一单克隆蛋白（Monoclonal-proteins)所导致的一组疾病。M蛋白疾病的“M”含义是Myeloma,Macroglobulinemia和Malignant l

8、ymphoma，Monoclonal Gammapathies均以“M”开头。M蛋白在电泳上表现为高而狭窄的尖峰（高/宽2:1）.,多发性骨髓瘤的临床特征：骨质疏松和溶骨现象 贫血，粒细胞、血小板减少 肾淀粉样变性损害 免疫功能低下，易感增加,多发性骨髓瘤的免疫学特征:,血中出现M蛋白,正常Ig水平明显减低尿中出现M蛋白和轻链蛋白(BJP)骨髓中浆细胞明显增加无免疫活性Ig导致免疫功能低下,巨球蛋白血症（Waldenstrom氏）,患者血中存在大量单克隆IgM，,血粘度明显增多，骨骼损害不常见，,疾病发展类似淋巴瘤。,轻链病,轻链病多表现为肾脏损害，极易误诊为慢性肾炎。我们认为轻链有3种形式出

9、现在血清或尿中；一是正常的轻链过剩（Kappa和Lambda同时出现），多出现于慢性肝病，SLE等多克隆增殖中。二是伴随轻链。三是单一轻链，血和尿中只出现单一增殖的大量轻链。,重链病,由于制造Ig的浆细胞发生突变，并恶性增殖，只产生重链或产生的重链有缺陷，因而轻链和重链不能组成完整的Ig，血中出现大量无免疫功能的Ig片段-重链，由此产生一系列重链病变。重链病是免疫蛋白的结构异常所致。常见三型。该病发病率极低。,M蛋白电泳图谱,M蛋白是单克隆性浆细胞或淋巴细胞大量增殖而产生的一种在氨基酸组成基排列顺序上十分均一的异常球蛋白，其本质是免疫球蛋白或其片断M蛋白在2区形成浓密区带用光度计可扫出基底较窄

10、，高而尖锐的蛋白峰其标准为：在区，蛋白峰的高和宽之比应2：1；在 区和2区应 1：1,位于区的单克隆IgA,单克隆带,寡克隆图案,轻链病,老年性单克隆带,位于2区单克隆带,多发性骨髓瘤的误诊原因分析,多发性骨髓瘤诊断标准,1.骨髓中浆细胞15，并有异常浆细胞（骨髓瘤细胞）或骨髓活检为浆细胞瘤。为主要的诊断依据。2.血清中出现大量单克隆免疫球蛋白（M蛋白），IgG35g/L；IgA20g/L；IgD2.0g/L；IgE2.0g/L；IgM15g/L或尿中出现单克隆免疫球蛋白轻链，轻链排出1g/24小时。3.无其他原因的溶骨病变或广泛性骨质疏松。,免疫固定电泳 对M蛋白的分型与鉴定 已作为实验室常

11、规工作,将待测血清或其他标本在琼脂平板上作区带电泳，分离后于其上覆盖含抗或轻链或各类重链的抗血清滤纸，当抗体与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合后，便形成复合物而沉淀下来，再通过漂洗与染色，呈现浓而狭窄的着色区带，即可判断单克隆丙种球蛋白的轻链和重链型别。,4人份琼脂糖凝胶固定免疫电泳,正常血浆免疫固定电泳,IgM重链及轻链,轻链型IgG并其他Ig缺乏,轻链型IgA并其他Ig缺乏,寡克隆带,移植病人之寡克隆带,艾滋病人之寡克隆带,游离轻链,Electrophoretic exploration of proteinuria,非浓缩尿蛋白电泳临床应用,肾单位生理及与血浆蛋白质关系,肾脏近二百万个肾单

12、位每天过滤1600 升血液并产生180升原尿，经肾小管重吸收后最终排出约1.5升终尿。,白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白微蛋白,白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白,微蛋白,肾小球滤过膜,肾小管重吸收,微蛋白,肾小管分泌(Thamm-Horsfall蛋白),终尿中白蛋白占1/3，球蛋白占 2/3。,尿蛋白定义,生理性尿蛋白为50 150 毫克天(大约 100毫克升以下)主要成分为白蛋白(30毫克天 以下)病理性尿蛋白为超过10 毫克天 蛋白质成分复杂多样,尿蛋白增加的原因,生理性：间歇性(体位,高蛋白饮食,剧烈运动后,精神压力大)肾前性：高血压，高热，心脏或肝脏衰竭,血中蛋白浓度过高(溢出性蛋白尿)肾性：肾小球或

13、肾小管损害(或两着均有)肾后性：泌尿生殖道损害,十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶电泳（SDS-AGE）技术的分析原理,SDS（Sodium Dodecysulphate）是一种阴离子型表面活性剂，当其浓度达蛋白质的5-10倍时，与还原剂共同作用，能使蛋白质分子内的氢建和二硫键断裂，解离成单独的亚基与SDS充分结合形成带负电荷的亚基-SDS胶束，所带电荷量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间的原有电荷差异。根据流体动力学的研究证明，这种复合物是椭圆形，短轴约为1.8A，但长轴的长度与亚基分子量的大小呈正比，加之琼脂胶的分子筛作用，使电泳的迁移率与摩擦系数的反比关系只表现在蛋白质分子

14、量大小上，因此尿蛋白各组分便可按分子量的大小顺序排列在琼脂糖凝胶上。,70 kDa,70 kDa,肾单位生理结构,肾小球滤过膜,肾小管重吸收,SDS-agarose gel electrophoresis十二烷基磺酸钠,SDS,SDS,尿蛋白电泳以分子量排列原理,SDS,SDS,+,-,分子量标记(kDa),14.4,30,43,67,94,低分子量(70 kDa),高分子量(70 kDa),白蛋白,Hydragel 尿蛋白电泳结果解释,分子量标记(kDa),14.4,30,43,67,94,白蛋白,肾小管标记,肾小球标记,Hydragel 尿蛋白电泳,溶菌酶,视黄醇结合蛋白,轻链,白蛋白,转

15、铁蛋白,免疫球蛋白,2-微球蛋白,微球蛋白,Ser,Ser,PM,Ser,Ser,肾小球滤过功能,低分子量蛋白质，小于 70kDa,可被滤过。其他影响每种蛋白质滤过的因数：形状，所带电荷，血浆浓度。滤过取决于肾动力参数。肾小球滤过膜的损害可导致大分子量的蛋白质(超过 70kDa)漏出。,肾小球性蛋白尿 产生原因,主要是肾小球受到炎症，毒素等的损害，引起肾小球毛细血管壁通透性增加，滤出较多的血浆蛋白，超过了肾小管重吸收能力所形成的蛋白尿。频发于成人及婴幼儿，一般尿蛋白总量常大于1000mg/天。常见于肾小球疾病如急性肾小球肾炎，某些继发性肾脏病变如糖尿病肾病，免疫复合物病如红斑狼疮性肾病等。,肾

16、小球损害,70 kDa,70 kDa,白蛋白,70 kDa,70 kDa,Ser,电泳图谱表现,表现为漏出性蛋白尿，出现白蛋白及分子量更大的转铁蛋白，免疫球蛋白，有时甚至出现2-巨球蛋白。分子量越大损伤越严重，这里可以初步估计出蛋白尿的选择性，作为判断肾小球损伤严重程度及肾小球病变预后评价的一个重要指标。,肾小管重吸收,肾小管可重吸收被肾小球滤出的低分子量蛋白质(70kDa)。(active endocytosis)99%被肾小球滤出的蛋白质可被肾小管重吸收，例如，白蛋白每天可被滤出18g，但在生理性终末尿中仅 30mg/天。肾小管损害可减弱对低分子量蛋白质(70kDa)的重吸收。当血浆浓度增

17、加超过肾小管重吸收阈值时，亦可出现低分子量蛋白质。,肾小管性蛋白尿 产生原因,主要是由于炎症或中毒等因素引起的近曲小管对低分子量蛋白质重吸收功能减退而出现以低分子量蛋白质为主的蛋白尿。一般尿蛋白总量小于500mg/天，持续时间短。常见于肾盂肾炎，间质性肾炎，肾小管性酸中毒，重金属（汞，镉，铋）中毒，应用庆大霉素，多粘菌素B及肾移植术后等。,肾小管损害,70 kDa,70 kDa,白蛋白,70 kDa,70 kDa,Ser,混合损害，以肾小管为主,电泳图谱表现,出现较多的轻链二聚体，微球蛋白，游离轻链，视黄醇结合蛋白，溶菌酶，2微球蛋白等低分子量蛋白质，且各蛋白组分所占比例较均一。其所含浓度越大

18、提示肾小管损伤越严重。婴幼儿肾小管性蛋白尿以视黄醇结合蛋白为主，而且尿视黄醇结合蛋白排泄量升高是较敏感的肾近曲小管损伤的诊断指标。,混合损害,70 kDa,70 kDa,白蛋白,70 kDa,70 kDa,肾前性蛋白尿,主要是由于高血压，高热，心脏或肝脏衰竭等造成血中蛋白浓度病理性升高，超过肾小管重吸收能力时所排出的包含各种特殊蛋白成分。原因游离轻链，见于多发性骨髓瘤 2 微球蛋白，见于淋巴组织增生综合征 溶菌酶，见于部分急性粒细胞白血病血红蛋白，见于溶血性疾病 1酸性糖蛋白,见于支气管肺癌肌红蛋白，见于横纹肌分解这些原因亦可导致肾脏病变(有游离轻链时，可见特征性 Bence-Jones 本-

19、周氏蛋白),肾前性蛋白尿（溢出性蛋白尿）,70 kDa,70 kDa,白蛋白,70 kDa,70 kDa,2号标本 经BME处理后,图谱表现,在电泳图谱中表现为溢出性蛋白尿，可在小分子区发现少量的深染条带注意要与肾小管损伤性蛋白尿区分。如多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦病及其他原因导致的淋巴系统病理性增殖，其电泳图谱与肾小管损伤性蛋白尿的主要区别在于本周氏蛋白谱带单一，各带含量大小很不均匀，自由轻链或轻链二聚体所占比例大于总量的30%；而肾小管损伤性蛋白尿，分子量小于白蛋白的各小分子量蛋白带出现较多，且各蛋白组分所占比例较均一。溢出性血（肌）红蛋白尿与肾小管损伤性蛋白尿的鉴别与本周氏蛋白尿相似，只是

20、具体谱带位置不一样而已。,肾后性蛋白尿,非肾损伤性情况下终尿中混入肾以下泌尿、生殖系血液成分、细菌菌体蛋白和毒素等蛋白质而引起的蛋白尿。常见于肾盂，输尿管，膀胱，尿道的炎症，肿瘤，结石。,图谱表现,细菌菌体蛋白和毒素在电泳实验中因其蛋白分子量及所带电荷与人体蛋白差异较大，在特定的实验条件下常不出现于电泳板的蛋白谱带可视范围内其鉴别关键在于将混入尿内的血液成分蛋白定性且结合临床表现及尿常规结果与肾小球损伤性和混合性肾损伤性蛋白尿加以鉴别。肾后性蛋白尿33KDa/70KDa比值远较肾小球损伤性和混合损伤性蛋白尿的比值要小160KDa/70KDa和160KDa/70KDa比值要远大于后两者。,其他项目,脑脊液蛋白电泳 血红蛋白电泳 糖化血红蛋白电泳 LDH同功酶和CK同功酶电泳 脂蛋白电泳,谢谢！,