微生物遗传变异本科.ppt

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1、第七章 微生物的遗传变异 Microbial Inheritance and Variation,本章目录,第一节 微生物的突变第二节 细菌的基因重组第三节 真核微生物的基因重组第四节 微生物遗传变异知识的应用第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,Inheritance 遗传：亲代与子代性状相似的现象,variation变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一,遗传保证了物种的存在和延续，而变异推动了物种的进化和发展,微生物是遗传学研究中的好材料：,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。繁殖速度快，能

2、在短时间内获得较多的代数和众多 的子代。易于人工培养。对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。,第一节 微生物的突变,一 突变体主要类型二 基因突变的特点 三 基因突变的机制 四 紫外线对DNA的损伤及其修复,一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变、可遗传、自发或诱变产生Mutation：是指遗传物质发生数量或结构变化的现象。,Gene Mutation基因突变,狭义：点突变广义：基因突变和染色体畸变,野生型（原始性状）：未发生突变的原来的菌株。,基因突变,突变型（新性状）：发生了突变的菌株,一 突变体主要类型,基因突变的类型极为多样。人们可从不同的角度进行分类,并给以不同的名

3、称。按突变体表型特征,可把突变分成以下几种类型:（一）形态突变型指突变引起细胞形态变化或引起菌落形态改变。如细菌的鞭毛、芽孢或荚膜的有无,菌落的大小、外形的光滑(S型)、粗糙(R型)和颜色等的变异;放线菌或真菌产孢子的多少、外形或颜色的变异等。（二）生化突变型指一类发生代谢途径变异但形态没有明显变化的突变型。该突变型可进一步细分为营养缺陷型、抗性突变型和抗原突变型3种类型。,营养缺陷型 auxotroph 指由于基因突变引起代谢过程中失去合成某种酶的能力，而无法合成某种必须的生长物质的突变型，只有加入相应的生长物质才能正常生长的变异菌株。抗性突变型 是一类能抵抗有害理化因素的突变型。据其抵抗的

4、对象可分抗药性、抗紫外线或抗噬菌体等突变类型。它在遗传学基本理论的研究中十分有用,常作为选择性标记菌种。发酵突变型 指从能够利用到不能够利用某种营养物质的突变型。4 毒力突变型 指突变后致病力增强或减弱的突变型。5 产量突变型 指产生某种代谢产物的能力增强或减弱的突变型。,(三)条件致死突变型-某菌株或病毒经基因突变后,在某种条件下可正常生长、繁殖并实现其表型,而在另一条件下却无法生长、繁殖的突变类型。温度敏感突变株(temperature-sensitive mutant,Ts突变株)是一类典型的条件致死突变株。例如,E.coli的某些菌株可在37下正常生长,却不能在42下生长等。某些T4噬

5、菌体突变株在25下有感染力,而在37下则失去感染力等。产生Ts突变的原因是突变引起了某些重要蛋白质的结构和功能改变,以致在某特定的温度下能发挥其功能,而在另一温度(一般为较高温度)下则该功能丧失。(四)致死突变型-由于基因突变而导致个体死亡的突变型。,1、随机性 randomness 自发性和不对应性 2、稀有性 突变率很低，很低稳定，一般在10-610-9之间。3、独立性 independence 即在某一群体中既可能发生抗青霉素的突变型，也可能发生抗链霉素的突变型而且还可以发生不属抗药性的突变型。4、可逆性 reversibility 任何性状的突变型都具可逆性，都可恢复为原来的野生型，回

6、复突变率同样很低。,二 基因突变的特点,5、稳定性 stability 突变后产生的变异性是稳定的，可遗传的。6 可诱变性 自发突变的频率可因诱变剂的影响而大大提高。,基因突变随机性的实验证明,三个经典实验变量实验涂布实验影印实验,证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。,野生型（原始性状）,突变型（适应环境的新性状）,变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or

7、 Medicine 1969,变量实验（fluctuation analysis）,Newcombe的涂布实验（1949）,影印实验（replica plating）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,Joshua Lederberg,J.Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958,三 基因突变的机制 mechanism of gene mutation,碱基置换可由互变异构和化学诱变引起。,（一）Base substitution 碱基置换,

8、1 互变异构,通常以氨基式出现的腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对，当DNA复制到这一位置瞬间时转变为稀有的亚氨基式(A)(互变异构现象，tautoomerism)，就会与胞嘧啶(C)碱基配对，这意味着一个胞嘧啶(C)插入DNA，代替了胸腺密啶(T)。假如在下一次复制周期前不被修复A-T碱基对将变为C-G碱基对。,碱基置换引起的突变,2 化学诱变剂引起的碱基对置换,碱基类似物(base analogs)如5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤。的结构与相似，当被掺入DNA分子本身对细菌无影响，但5-BU有酮式和烯醇式的互变且出现烯醇式的的机会多，当5-BU为烯醇式时,与G配对而不与A配对。这时增加了转换为的

9、频率。,指分子中添加或缺失少数几个碱基对，而造成其后面全部遗传密码发生转录和翻译错误的基因突变。密码子全部移动，导致合成不正常蛋白质，引起性状改变。,GGG AAA UUU AAA CCC甘 赖 苯丙 赖 脯AGG GAA AUU UAA ACC C精 谷 异亮 终止,（二）移码突变,由于某些理化因素的作用造成分子的大损伤所引起的突变。包括染色体的缺失、重复、插入、易位、倒位。,（三）染色体畸变,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,嘧啶二聚体,嘧啶,光解酶,四、紫外线对DNA的损伤及其修复1、光复活作用,2、切除修复,第二节 细菌的基因重组,一转化二 转导三 接合四 原生质体融合,基因重组是两个不同性状的

10、个体细胞，其中一个细胞内的基因转移到另一个细胞内并通过基因重新组合使之发生遗传变异的过程。,供体菌,受体菌,DNA片段,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行自然转化。,Transformation转化是受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段,通过变换将其整合到自己的基因组中,从而获得供体菌部分遗传性状的现象。,一Transformation 转化,转化需要二方面必要的条件1、建立了感受态的受体细胞感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特

11、性，受细菌 自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的 能力，或人为地将DNA导入细胞内2、外源游离DNA分子（转化因子）,转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）,a）对核酸酶敏感；b）不需要活的DNA供体细胞；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多,转化过程的特点：,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式 一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中,细菌转导的类型：,普遍转导,局限转导,完全普遍转导流产普遍转导,低频转导高频转导,局限转导与普遍转导的主要区别,溶源

12、转变,二 转导（transduction）,噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程,普遍性转导的三种后果：,外源DNA被降解，转导失败。,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子,流产转导,普遍转导（generalized transduction）,完全普遍转导,转导DNA不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，在选择培养基平板上形成微小菌落,流产普遍转导,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数

13、宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,局限转导,局限转导与普遍转导的主要区别：,a）局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。,通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间

14、平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。,三 接合(conjugation),证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（Bernard Davis，1950）,“接合”“转导”及“转化”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：,外源DNA的来源及进入途径有差异,四、原生质体融合,第三节、真核微生物的基因重组,一 有性生殖二 准性生殖,细胞（）细胞（）,有性接合 染色体重组 新遗传型,能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交,一 有性生殖,细胞（）细胞（）,准性接合 基因重组 新遗传型,菌丝联结 质配 核配 有丝分裂交换 单倍体杂合子,在半知菌类

15、中最为常见,半知菌的准性生殖,二 parasexual reproduction 准性生殖,第四节 微生物育种,一、诱变育种1、诱变育种的一般方法2、诱变育种的原则3、突变株的筛选4 营养缺陷型的筛选方法二、基因工程,一 诱变育种,指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。1、诱变育种的一般方法（1）出发菌株的诱变处理A 出发菌株的选择 出发菌株是用于诱变育种的原始菌株。选择原则是：具有有利性状和对诱变剂敏感。选择时期是：应选择菌体的对数期，孢子和芽孢的萌发前期。选择对象是：孢子和芽孢,诱变剂的选择 选择最适诱变剂量,B 诱变剂的选择

16、选择原则是：方便性和有效性。应用较多的有：紫外线、亚硝酸、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（NTG）、亚硝基甲基脲（NMU）等。C 选择最适诱变剂量 常以杀菌率表示其相对剂量。采用杀菌率为30%75%的相对剂量，容易出现更多的突变。,（1）使用简便有效的诱变剂,诱变剂,物理因素,化学因素,紫外线激光离子束X射线r射线快中子,烷化剂碱基类似物吖啶化合物,2、诱变育种的原则,（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液（4）使用最佳诱变剂量 剂量=强度（浓度）作用时间 相对剂量=杀菌率（5）利用协同效应（6）寻找和利用形态、生理与产量间的相关指标（7）设计高效率筛选方案（8）根据具体情况

17、创造新型筛选方案,（1）产量突变株的筛选（2）抗药性突变株的筛选（3）营养缺陷型突变株的筛选,3、突变株的筛选,完全培养基：在基本培养基中添加天然物质后能满足某种微生物各种营养缺陷型的营养要求的加富培养基。补充培养基：在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的加富培养基。,中间培养,营养缺陷型的检测,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,抗生素法菌丝过滤法梯度培养法差别杀菌法,夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法,生长谱法,4 营养缺陷型的筛选方法,特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性,定义：指用人工方法通过体外基因重组和载体的作用，把目的基因导入受体细胞并在其中复制和

18、表达，从而形成新物种的育种新技术。即在基因水平上，改造遗传物质，从而使物种发生变异，创建出具有某种稳定新性状的生物新品系。,二、基因工程,获得目的基因（目的基因制备）选择基因载体体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定应用,基因工程的基本操作,微生物学与基因工程的关系,（1）基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；（2）基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到；（3）微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；,（4）大

19、规模表达各种基因产物，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母中构建成工程菌，利用工厂发酵来实现；（5）微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供极其丰富而独特的基因资源；（6）有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术同时也提供了理论指导。,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染；c）死亡。,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变,纯菌种,自发突变,不纯菌种,突变个体,传代增殖,原始

20、个体,衰退菌种,衰退：指群体中退化个体在数量上占一定比例后，表现出菌种生产性能下降或优良性状丧失的现象。对产量性状来说，菌种的衰退是菌种出现或表现出负变性状。,一、菌种的衰退与复壮,菌种衰退的表现,1 产量的降低。2 菌落和细胞形态的改变。3 生长速度变得缓慢，产生孢子越来越少。4 代谢产物生产能力或其对寄主寄生能力下降。5 抗不良环境条件能力的减弱。,菌种的复壮的方法：a）纯种分离；b）通过寄主体进行复壮；c)淘汰已衰退的个体,菌种的复壮：是指菌种已发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的菌种找出尚未衰退的个体，从而恢复该菌种原有典型性状的一种措施。,二、防止衰退的措施,1）减少

21、传代次数 菌种传代次数越多,产生突变的几率就越高,因而菌种发生衰退的机会就越多；2）创造良好的培养条件 创造适合原种生长的条件可以防止菌种衰退；3）利用不同类型的细胞接种传代 在放线菌和霉菌中,它们的菌丝常含有几个核,若用菌丝接种就会出现不纯和衰退。而孢子一般是单核的,接种就没有这种现象。,4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查 通过纯种分离可把退化菌种中的一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经过扩大培养就可恢复原菌株的典型性状。5）采用有效的菌种保藏方法 在工业生产用的菌种中,主要的性状都属于数量性状,而这类性状是最易衰退的。即使在较好的条件下,还会存在这种情况。,目的：在一

22、定时间内使菌种不死亡、不污染、不混乱，并稳定保持原有特性。,基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种 2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体 3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株,菌种保藏就是用人工的方法降低微生物代谢强度，限制其生长和繁殖，使其处于休眠状态，以保持优良的遗传性状，减少变异性。,三、菌种保藏,常用的菌种保藏方法：低温保藏法隔绝空气保藏法干燥保藏法寄主保藏法,基本方法,培养基传代培养（斜面、平板）,寄主传代培养,低温（液氮、低温冰箱）,干燥（沙土管、真空干燥）,生活态休眠态,冷冻干燥保藏法和液氮保藏法,练习八,一、为什么说微

23、生物是遗传学研究中的好材料？二、防止菌种衰退的措施有哪些？三、名词解释突变、菌种保藏、普遍性转导、局限性转导、转化,什么是菌种衰退，复壮？如何防止菌种衰退?,菌种衰退：由于微生物多单细胞，易受环境条件作用，繁殖较快，变异可在较短时间内积累。菌种自发变异导致不利变异大量积累，导致菌种生产性能（生长速度及产量下降、抗性能力下降）即菌种衰退。菌株衰退是一量变到质变的过程，初始时，细胞群体中，仅有少量细胞负变，如不及时处理，任其无限移种传代，群体中负变个体数量逐渐增大并居优势，整个细胞群体严重衰退。,菌种复壮：复壮是菌种发生衰退时通过纯种分离并测定生产性能得方法从衰退群体中筛选未衰退得少量个体，以使其

24、恢复原有典型性状。,防止菌种衰退方法：1）减少传代次数 菌种传代次数越多,产生突变的几率就越高,因而菌种发生衰退的机会就越多；2）创造良好的培养条件 创造适合原种生长的条件可以防止菌种衰退；3）利用不同类型的细胞接种传代 在放线菌和霉菌中,它们的菌丝常含有几个核,若用菌丝接种就会出现不纯和衰退。而孢子一般是单核的,接种就没有这种现象。,4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查 通过纯种分离可把退化菌种中的一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经过扩大培养就可恢复原菌株的典型性状。5）采用有效的菌种保藏方法 在工业生产用的菌种中,主要的性状都属于数量性状,而这类性状是最易衰退的。即使在较好的条件下,还会存在这种情况。,试题题型,一、单项选择题二、名词解释三、填空题四、简答题五、问答题,