微生物遗传变异与育种.ppt

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1、第七章 微生物遗传变异与育种,生物亲代与子代之间,在形态、结构和生理功能上常常相似，这就是遗传现象。正是生物的遗传特性,使生物界的物种能够保持相对稳定.,生物的各项生命活动都有它的物质基础。生物遗传的物质基础是什么呢？,根据现代细胞学和遗传学的研究得知,控制生物性状的主要遗传物质是脱氧核糖核酸。,1.遗传与变异的基本概念,遗传(heredity):亲代生物的性状在子代得到表现;亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息.特点:具稳定性.,遗传型(genotype):又称基因型,指某一生物个体所 含有的全部基因的总和;是一种内在可能性或潜力.,表型(phenotype):生物体所具有的一切

2、外表特征和内在特性的总和;是一种现实存在,是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状.,变异(variation):生物体在外因或内因的作用下,遗传物质的结构或数量发生改变.变异的特点:a.在群体中以极低的几率出现,(一般为10-610-10);b.形状变化的幅度大;c.变化后形成的新性状是稳定的,可遗传的.,饰变(modification):指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化.特点:几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化;性状变化的幅度小;因遗传物质不变，故饰变是不遗传的.引起饰变的因素消失后,表型即可恢复.,2.遗传变异的物质基础,DNA作为主要的遗传

3、物质具备以下几个特点:,分子结构具有相对的稳定性,能够自我复制,使前后代保持一定的连续性,能够指导蛋白质的合成,从而控制新陈代过 程和性状,能够产生可遗传的变异,2.1 DNA作为遗传物质的实验证据之一 肺炎链球菌的转化现象,1928年，格里菲斯(Griffith)以肺炎链球菌为研究对象，发现了S型菌株和R型菌株发生转化的现象。,1944年，艾维里(Avery)通过进一步的转化实验弄清楚了Griffith实验中的转化因子的实质。,肺炎链球菌体外转化实验,2.2 DNA作为遗传物质的实验证据之一 E.coli噬菌体T2的感染实验,1952年,侯喜()和蔡斯(M.Chase)用同位素示踪法研究了大

4、肠杆菌噬菌体T2的感染过程。,2.3 RNA作为遗传物质的实验证据 烟草花叶病毒(TMV)的重建实验,1956年,H.Fraenkel-Conrat用含RNA的TMV所作的著名的植物病毒重建实验证明TMV的主要感染成分是其核糖核酸RNA。,病毒重建实验示意图(引自Klug and Cummings，2000),3 微生物的染色体分子结构,真核微生物染色体,(1)染色质与染色体,由DNA和蛋白质及少量RNA组成的一种复合物，其中DNA的含量约占染色质重量的30。由于在细胞分裂间期所表现的形态呈纤细的丝状结构，故称为染色质；而在有丝分裂中期，这种复合物呈棒状体，故称为染色体。实质上，这两个概念是同

5、一种物质在不同时期表现出不同状态而也。,(2)异染色质与常染色质,异染色质和常染色质只是染色质在细胞分裂间期螺旋化程度的不同。常染色质表现为呈松散状态，而异染色质高度螺旋化，呈紧密卷缩状态。染色质的这种结构与功能密切相关，常染色质可经转录表现为活跃的遗传功能，而异染色质一般不编码蛋白质，只对维持染色体结构的完整性起作用，如着丝粒区域就属于一种异染色质。,异染色质：染色质线中染色很深的区段。,常染色质：染色很浅的区段。,(3)染色质的基本结构单位 核小体,核小体结构模型,(4)染色体的基本结构 染色单体,染色体的结构是由两条染色单体(chromatid)组成的。,每条染色单体实际上就是一个DNA

6、分子与蛋白质结合所形成的染色质线。,细胞分裂过程中染色质线是怎样卷缩成为一定形态结构的染色体？,是核小体的长链进一步螺旋化形成直径约为30nm的超微螺旋，称为螺线管，组蛋白H1参与作用。,是DNA分子超螺旋化形成核小体，组蛋白H2A、H2B、H3和H4参与作用。,是染色体螺旋管进一步卷缩,并附着于由非组蛋白所形成的骨架上。,着丝粒和端粒,着丝粒，又叫着丝点，是染色体的缩缢部位，是细胞分裂过程中纺锤丝(spindle fiber)结合的区域。,次缢痕：近端着丝粒染色体的短臂上，常与核仁的形成 有关核仁组织区（NOR）。随体：染色体末端、与次缢痕相连的棒状小体(satellite),由异染色质组成

7、，是识别染色体形态的重要特征 之一。端粒 是真核生物线性染色体末端由重复DNA序列和蛋白质结合 形成的复合结构。特点:端粒通常由富含鸟嘌呤核苷酸的短的串连重复序列 DNA组成，而且同一个基因组内所有端粒都是由相 同的重复序列组成，但不同物种的端粒的重复序列 是不同的。,端粒的功能,染色体末端的保护作用；引导同源染色体的配对；端粒和细胞癌变有关；无限增殖和分化障碍是癌细胞的重要生物学特性。一般认为，在细胞癌变过程中因端粒酶的活性增强，端粒的长度得以维持，染色体形态得到稳定，从而逃脱了因端粒缩短而引起的细胞死亡，使细胞达不到终末分化，获得永生化。染色体端粒的长短可决定细胞寿命；决定细胞衰老的“生物

8、钟”就是染色体末端的端粒DNA，它可随着年龄的增长而缩短。,原核微生物拟核体,与真核生物相比，原核微生物的染色体通常只有一个核酸分子(DNA或RNA)，其遗传信息的含量比真核生物少得多。病毒染色体只含一个DNA或者RNA分子，可以是单链也可以是双链；大多呈环状，少数呈线性分子。细菌染色体均为环状双链DNA分子。,大肠杆菌的基因组约2.2109 Da，DNA长约1200m。而菌体直径仅仅12m。,大肠杆菌染色体,DNA这种高度折叠的结构使DNA分子长度压缩了千余倍。,代表性生物体内基因组大小,4 微生物基因组,基因组(genome):某一物种的单倍体的所有染色体上遗传物资的总称。,原核生物，一般

9、只有一套基因，即单倍体(haploid)；而真核生物通常具有两套基因，称为二倍体(diploid),原核生物的基因组特点,1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；,链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的致密结构。,2）基因组上遗传信息具有连续性,微生物基因组DNA绝大部分用来编码蛋白质、RNA；其余用作复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等信号序列。,除了个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tRNA中也发现有内含子或间隔序列

10、外，原核微生物一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。,3）功能相关的结构基因组成操纵子结构,4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝,5）基因组的重复序列少而短,操纵子（operon）：功能相关的几个结构基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点（启动子、操作子等）在基因转录时协同动作。,6）基因重叠是病毒基因组的结构特点，即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子。,1）典型的真核染色体结构，基因组远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小2）真核细胞基因转录产物为单顺反子，即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA分子，一条多肽链。3）基因

11、组中不编码的区域多于编码区域。4）基因是不连续的，结构基因内部存在许多不编码蛋白质的间 隔序列，称为内含子，编码区则称为外显子。5）重复序列多，包括高度重复序列、中度重复序列和 低度重复或单拷贝序列等。,真核生物的基因组特点,5 染色体外遗传成份,5.1 原核微生物核外遗传物质,质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,(1)质粒的分子结构,通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简 称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒;质粒分子的大小范围从1kb左右到

12、1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）,质粒的检测,提取所有胞内DNA后电镜观察,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。,质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的 机能，从而使宿主得到生长优势。,质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应,致育因子（Fertility factor，F因子）抗性因子（Resistance factor，R因子）产细菌素的质粒(Bacteriocin production plasmid）毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（Metabolic p

13、lasmid）隐秘质粒（cryptic plasmid）,5.1.1 质粒的主要类型,1)致育因子(F因子)能于染色体外独立增殖的环状DNA分子，其大小约 100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现 象有关的质粒。由于这种质粒还可以整合到细菌染色 体上，成为染色体的一部分，又叫作附加体。F质粒整 合到宿主细胞染色体上的菌株叫Hfr.,携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）,环形的F因子主要包括 四个部分：原点，转移的起点；形成性伞毛的基因；DNA复制酶基因；插入序列，与插入到细 菌染色体的过程有关。,2)抗性因子（R因子）包括抗药性和抗重

14、金属二大类，简称R质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R100质粒可使宿主对下列药物及重金属具有抗性,并 且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上：汞(mercuricion,mer);四环素(tetracycline,tet)链霉素(Streptomycin,str);磺胺(Sulfonamide,Sul)氯霉素(Chlorampenicol,cml);西地酸(fusidic acid,fus)。,R100抗性质粒的遗传图谱示意图,R因子的特征：,1）能自行重组，即来自两种不同耐药菌株的R因子基因整 合在一起，构成多重耐药菌株2）R因子也能借助性纤毛进行接合而传

15、递,而且R因子和F因 子之间也能发生重组,但R因子不能整合到核染色体上3）R因子一般由相连的二个DNA片段组成。一是RTF质粒（resistance transfer factor,抗性转移因子），它 含调节DNA复制和转移的基因；二是抗性决定质粒（r-determinant），含有抗性基因。,R因子的结构组成,3)产细菌素的质粒(Bacteriocin production plasmid),细菌素结构基因、涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋白质的基因、赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因,细菌素的一般命名规则：,大肠杆菌产生的细菌素为大肠杆菌素(colicin

16、s),而产生这种细菌素的质粒被称为Col质粒。,通过抑制复制、转录、翻译或能量代谢等而专一性地杀死近缘且不含Col质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影响，质粒本身编码一种免疫蛋白，从而使宿主对大肠杆菌素有免疫作用。,作用机理：,许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。,产毒素E.coli是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一,其中许多菌株含有编码一种或多种肠毒素基因的质粒。苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致 病因子,4)毒性质粒（virulence plasmid）

17、,Ti质粒的结构及特点,环状dsDNA,160-250kb，六个功能区致瘤区：合成植物生长素和细胞 分裂素冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解质粒转移区(tra)：参与不同农杆 菌中的接合转移毒（性）区：参与T-DNA的转移和 插入植物染色体DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制,5)代谢质粒（Metabolic plasmid）,质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。,将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。如假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如苯、辛烷和樟脑等

18、的能力。,降解质粒：,巨大质粒：又叫共生质粒。发现于根瘤菌属中的一些成员，质粒上 有一系列固氮基因。,6)隐秘质粒（cryptic plasmid）,隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。,在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）,5.1.2 质粒的特性,质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄 主细胞系中稳定地共存的现象。质粒的稳定性 正常条件下质粒在细胞分裂前复制，其特殊的分配 机制以保证其在子代细胞中的均等分配，从而实现 质粒遗传的稳定。

19、,5.1.3 质粒作为载体的优点,1、体积小，便于DNA的分离与操作2、呈环状，使其在化学分离过程中能保持性能稳定。3、有不受核基因组控制的独立复制起始点。4、拷贝数多，使外源DNA可很快扩增。5、存在抗药性基因等选择性标记。,5.2 真核微生物核外遗传物质,(1)真核微生物质粒 酵母菌的2m质粒，其特点：,封闭环状的双链DNA分子，周长约2m(6kb左右)高拷贝数存在于酵母细胞中，每个单倍体基因组含 50-100个拷贝均含有长600bp左右的一对反向重复序列在细胞内以两种异构体(A和B)形式存在；不赋予宿主任何遗传表型，属隐秘性质粒。,酿酒酵母菌中的2m质粒,几乎所有的酿酒酵母菌 中都含有2

20、m质粒，其 拷贝数高达50100。IRs：反向重复序列，约600bp,可重组。FLP：编码产物可驱动 IRs的同源重组。REP：控制质粒的稳定 性。STB：REP的结合位点。,2m质粒的应用 主要是作为酵母外源基因的克隆或表达载 体，如穿梭质粒载体的构建等。穿梭质粒载体的特点 同时具备真核生物和原核生物的复制起点，能 在两种生物细胞中进行复制的载体形式。,(1).整合质粒(2).附加体质粒(3).复制质粒,整合质粒（yeast integration plasmid，YIp）含pBR322的复制起点和Ampr、Tetr以及酵母的筛选标记URA3基因，但缺乏酵母的复制起始位点，所以，它只有整合到

21、酵母染色体中才能稳定。附加体质粒（yeast episomal plasmid，YEp）含pBR322的复制起点和Ampr、酵母筛选标记URA3和2m质粒DNA片段(复制起始部位和rep基因)。因此，这样的质粒以附加体形式在真核细胞中复制，YEp质粒拷贝数高且较稳定。复制质粒（yeast replicating plasmid，YRp）含pBR322的复制起点和Ampr、Tetr以及酵母的筛选标记URA3和酵母DNA的自主复制序列ARS（autonomous replication sequence），在真核细胞中独立自主的复制，拷贝数高但不稳定。,(2)真核微生物线粒体,mtDNA是双链环状

22、的分子，由于缺乏组蛋白，故不组成核小体。在线粒体中有和细菌细胞相似的类核区每个类核中含有几个拷贝的线粒体染色体。基因间没有间隔，因此每个基因不可能都有自己的启动子。线粒体含有的核糖体是负责线粒体中蛋白质合成的,但线粒体的核糖体蛋白大部分由核基因编码。,线粒体DNA含有的大量线粒体成份的信息，如rRNAs，tRNAs和蛋白。,某些蛋白质的密码子与核基因通用密码子不同。,转座子：能改变自身位置的一段DNA序列。,6 转座遗传因子,共同特征,携带编码转座酶的基因，即转座所必需的.两端都有反向重复序列.,最简单的转座子只含与转座有关的基因和序列，称为插入序列(Insertion sequence，IS

23、）,DNA转座的一般模式,复合式转座子,一类携带某些抗药性基因的转座子，其两端往往是两个相同或高度同源的IS序列,表明IS序列插入到某个功能基因两端时很可能产生复合转座子。,复合转座子（类型I）,复杂转座子（类型II）,复杂转座子（TnA家族）,转座子机制,复制型转座在转座子和靶位点两端分别交错切割产生切口;转座子和靶位点的切口末端交互连接(a-f,g-d),形成一 种交换结构；以游离的3末端作为引物进行复制，产生一个包含两个正向重复的转座子拷贝的复合物，称为共合体，这一过程在转座酶作用下进行；,转座子的两个拷贝在res位点发重组，在解离酶的作用下进行，释放两个复制子。,非复制型转座,转座子插

24、入到DNA上新的位点，首先交错切开靶DNA，再将转座子连接到靶DNA的凸出单链上，最后填补空缺完成转座。,转座的遗传学效应,插入突变 如果插入某操纵子的前半部分，可能造成极性 突变,导致改操纵子后半部分结构基因的表达 失活。产生新的基因,引起生物进化产生染色体畸变 复制性转座发生在宿主DNA原有为点附近时，往往会导致转座子两个拷贝之间的同源重组，引起DNA缺失或倒位。,反向重复区配对,转座引起的染色体DNA倒位示意图,7 基因突变,突变是指遗传物质本身发生根本的变化。广义的突变包括染色体变异和基因突变或点突变。狭义的突变单指基因突变,它是指一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变。,自发突变

25、 环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致,一般频率较低，通常为10-6-10-9。,诱发突变人们利用某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。,7.1 基因突变的特征,不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。,自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。,稀有性：突变率低且稳定。,独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。,可诱发性：诱变剂可提高突变率,一般可以将突变率提高10105倍。,可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（back mut

26、ation或reverse mutation）。,稳定性：变异性状稳定可遗传。,基因突变的自发性和不对应性的证明,在各种基因突变中，抗性突变最为常见，但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。,另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对称的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。,一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。,变量实验,Luria.S and Delbruck.

27、M(1943),结果,来自甲管的50皿中，各皿间抗性菌落数相差悬殊，而来自乙管的则各皿数目基本相等。,解释,说明抗噬菌体性状突变，不是由于环境因素噬菌体诱导出来的，而是在它们接触噬菌体前，在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的。,Newcombe的涂布实验-固体平板培养法(1949),要点：取其中6皿直接喷上T1噬菌体，另6皿则先用灭菌玻棒把微菌落重新均匀涂布一次后同样喷上等量的T1噬菌体，培养后发现，涂布过的一组有抗性菌落353个，比未涂布过的（仅28个菌落）高得多。这说明该抗性突变发生在未接触噬菌体前，噬菌体的加入不是诱导突变的因素。,影印实验,1952年，莱德伯格夫妇设计了一种更巧妙的影

28、印培养试验，直接证明了微生物抗药性是自发产生的，与相应的环境因素并不相干。,结论,以上三个实验充分说明了抗性突变是菌体接触所抗物质以前就已经自发产生了，药物并不是诱变因素，含药物的环境只起筛选和鉴别抗性菌株的作用。,7.2 突变类型,按方法分：按突变株的表型是否能在选择性培养基 上加以鉴别来区分,诱发因素主要可以分为细胞外因素、细胞内因素和DNA分子内部因素三个层次。,细胞外的诱发因素,自然环境或人工条件下的物理和化学因素。,化学：自然人造的化学诱变因素有低剂量的金属离子、高分子化合物、生物碱药物、染料及微生物产生的H2O2、碱基类似物、烷化剂及亚硝酸盐等。,物理：自然或人造的紫外线、射线、X

29、射线、快中子、激光以及加热等都能成为基因突变的物理因素。,7.3 诱发因素,细胞内的诱发因素,生物体细胞的代谢活动会产生一些诱变物质，如过氧化氢、咖啡碱和重氮丝氨酸等，它们是引起自发突变的内源诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能就是这类原因。,DNA分子内部因素,DNA分子中的碱基存在着互变异构效应,碱基的互变异构效应,四种碱基的第6位是酮基（T，G）或氨基（A，C）碱基T和G能够以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现 碱基C和A能够以氨基式或亚氨基式两种互变状态出现 一般生理条件下，碱基互变平衡反应倾向于酮式或氨基式，故A:T和C:G碱基配对,互变异构效应引起的不正常的碱基

30、配对,7.4 突变机制,染色体数目的变化,染色体结构的变化,染色体数目变化都可能引起生物表型的变化。原核微生物只有一条DNA，若从外源获得一段DNA，且与细胞的部分DNA同源，则称为部分双倍体。与染色体结构变化同属于染色体畸变,这是一种大段DNA变化（损伤）现象，它包括染色体缺失(deletion)、插入（insertion）、重复(duplication)、倒位(inversion)和易位(translocation)，,缺失,重复,倒位,易位,染色体局部座位内的变化,即基因突变(gene mutation)，因为突变只发生在一个基因座位内，所以，又称点突变(point mutation)。

31、,基因突变与染色体畸变的区别在于基因突变仅仅是DNA链中一对或少数几对碱基发生了变化。,基因突变可分为碱基置换(substitution)、移码突变(frame-shift mutation)、缺失(deletion)和插入(insertion)四种形式。,碱基置换,嘧啶（或嘌呤）碱基的位置上置换成另一嘧啶（或嘌呤）碱基则称为转换（transition）,原来链上是嘧啶（或嘌呤）碱基的位置上置换成另一嘌呤（或嘧啶）碱基则称为颠换(transversion),移码突变,一对或少数几对邻接的核苷酸的增加或减少，将造成这一位置以后一系列密码子发生移位错误的现象,如果增加或减少的核苷酸数目为3或3的倍

32、数，那么，它只改变某一部位的一个或几个氨基酸，其它氨基酸未变，有可能保持原有的蛋白质性质，这取决于这些氨基酸在蛋白质中的重要性。如果增加或减少的核苷酸数目不是3或3的倍数，那么，这会改变整个蛋白质的氨基酸顺序，其影响可能很大。,缺失或插入,与移码突变只是程度不同，基因突变中的缺失或插入涉及到的核苷酸数量比移码突变多，很难用移码突变来回复。但与染色体畸变中的缺失或插入相比，它们所变化的范围要小得多。,7.5 突变结果,错义突变:使所表达的蛋白质中一种氨基酸的位置上,变成另一种氨基酸.,无义突变:正常翻译为氨基酸的碱基置换后变成UAG(琥珀突变)、UAA(赫石突变)或UGA(乳石突变)等终止密码子

33、,造成多肽链合成的中止.,同义突变:碱基发生了置换,但由于遗传密码子的简并性,而并没有影响原来的氨基酸顺序.如密码子GCU置换成GCC后,它们都是丙氨酸的密码子.,营养缺陷型（auxotroph）,表型判断的标准：,在基本培养基上能否生长,7.6 常见的微生物突变类型,一种缺乏合成其生存所必须的营养物(包括氨基酸、维生素、碱基等)的突变型,只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物(precursor)才能生长.,营养缺陷型（auxotroph）,在选择性培养基（一般为基本培养基）上不生长,负选择标记突变株不能通过选择平板直接获得,营养缺陷型特点：,营养缺陷型的表示方法：,基因型：用his

34、C-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。表现型：第一个字母大写，且不用斜体：HisC,抗药性突变型,基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。,表示方法：,所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示strr和 strs分别表示对链霉素的抗性和敏感性,正选择标记突变株可直接从抗性平板上获得在加有相应抗生素的 平板上,只有抗性突变能生长.所以很容易分离得到.,条件致死突变型,特点：,负选择标记这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因,常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts表示，这类突变在高温下（如42）是致死的，但可以在低温（如25-30）下得到这种突变。,在某一条件下

35、具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。,特点:,非选择性突变突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。,举例:,产蛋白酶缺陷突变株的筛选菌落颜色变化,形态突变型,其它突变类型,毒力、生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用中具有重要意义的突变类型,一般都不具有很明显或可直接检测到的表型。其突变株的获得往往需要较大的工作量。,7.7 诱变剂(自学)与致癌物质Ames试验,能以各种机制导致DNA突变的化学物质被称之为诱变剂。那么，这些物质对人类具有什么意义呢？,b)对有害微生物进行控制,a)利用各种诱变剂获得各类遗传突变,进行诱变育种,c)危害人类自身的健康,诱变剂的共

36、性原则化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。,研究表明,超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用,90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。,回复突变(reverse mutation或back mutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。,用细菌突变来检测环境中是否存在致癌物质的一种快速、简便的方法。,检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率。,实验目的:,具体操作:,Ames试验,Ames试验中为什么要除去受试物中的组氨酸?,基因重组（gene recomb

37、ination）是两个独立基因组内的遗传基因，通过交换与重新组合形成新的稳定基因组的过程。,原核微生物基因组通常只是部分遗传物质的转移和重组,并且通过转化、接合和转导等形式进行。,真核微生物的基因重组发生在有性繁殖过程中,通过减数分裂后整套染色体发生高频率交换。,真核微生物中的部分真菌存在不通过减数分裂而在有丝分裂过程产生低频率基因重组的准性生殖方式。,8 基因重组,细菌的三种基因转移形式,8.1 原核生物的基因重组,接合：细胞与细胞的直接接触(由F因子介导),转导：由噬菌体介导,自然转化：游离DNA分子+感受态细胞,细菌的接合作用,(1).大肠杆菌重组的实验证明,1946年，Joshua L

38、ederberg 和 Edward L.Taturm进行的细菌多重营养缺陷型杂交实验。,通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。,大肠杆菌重组的证明,另一个证明试验“U”型管实验（Bernard Davis，1950）,(2).大肠杆菌性别的发现,A菌株：met-bio-thr+leu+thi+B菌株：met+bio+thr-leu-thi-,结论:E.coli中遗传物质的交换非交互式。那么A、B菌株之间这种单向的遗传物质的交换由什么引起呢？,(3).F因子与高频重组,大肠杆菌中供体与受体的区别：是否具有一种微小的质粒-F因子（F factor或 F element)，又称性

39、因子或致育因子。供体含有F因子，此菌株就称为F+，受体不含F因子，此菌株就称为F-。,F因子及其在杂交中的行为,F因子向F-细胞转移图解,Hfr的形成及其染色体向F-细胞转移图解,(b).Hfr品系称为高频重组（high frequency recombination，Hfr）：因为Hfr细胞与F-细胞接合后可以将供体染色体的一部分或全部传递给受体F-，当供体和受体的等位基因带有不同标记时，在它们之间就可以发生重组，重组频率可达到0.01以上。,(a).F+品系称为低频重组（low frequency recombination，Lfr)：F因子转移频率很高，但两者染色体之间重组频率很低，大约

40、是每百万个细胞发生一次重组。,(4).F因子与性导,F因子:Hfr转变为F+因子的时候，F因子偶尔可能获得细菌染色体的一部分,而保留着对遗传地点的“记忆”。这种带有部分细菌染色体的F因子称F因子。当F因子再整合到细菌染色体时，它就只能在原来的地点配对、交换而插入其中，而不能象F因子那样可以在任何位点整合。F菌株：指带有F因子的细菌。,性导 F因子转入受体细胞后，由于引入体细胞的部分基因，从而形成部分二倍体，这种利用F因子将供体细胞的基因导入受体形成部分二倍体的过程叫性导（sexduction或F-duction）,(5).细菌重组的主要特点,.F-细胞得到的只是F因子的一部分，F因子其余部分依

41、赖于整条Hfr染色体的转移，这样HfrF-杂交中选出的大多数重组子仍为F-。,.F-受体细胞只接受部分的供体染色体，这样的细胞就称为部分二倍体或称为半合子。供体与受体的重组是内基因子(F-染色体DNA)与外基因子(Hfr部分染色体DNA)的同源部分配对、交换，产生重组子。其中单交换产生的是不平衡的部分二倍体线性染色体，而双交换产生的是有活性的环状重组子和片段。,(a):接合后形成的部分二倍体，包括外基因子和内基因子；(b):内基因子和外基因子之间单交换形成一个线性染色体；(c):双交换形成一个完整的重组染色体和一个游离片段，这一片段随以后的分裂而丢失。,细菌的转导(transduction),

42、概念：以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程，称转导。包括普遍性转导和特异性转导。,发现:Lederberg及其研究生Zinder（1951）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，结果通过对二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌所进行的实验，首次在鼠伤寒沙门氏菌中发现转导现象。,（一）普遍性转导,管的中间用烧结玻璃滤板隔开，它只允许液体和比细菌小的颗粒通过.,管的右臂放溶源性细菌LA-22(受体),左臂放敏感菌LA-2(供体),用泵交替抽吸,使两端的液体来回流动,LA-22端出现了原养型的个体,实验现象,溶源性菌株LA-22 中少数细胞在培养过程中自发释放出温和型噬菌体P

43、22,通过滤板感染另一端的敏感菌株LA-2,LA-2裂解后,产生大量的“可滤过因子”,其中极少数在成熟过程中包裹了LA-2的DNA片段(含try+基因),通过滤板再度感染LA-22,重组后得到原养型（his+,try+）的转导子,鼠伤寒沙门氏菌的普遍性转导,那么，转导噬菌体为什么会“错”将宿主的DNA包裹进去?,噬菌体的DNA包装酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳，形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。,又因为染色体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同,利用效率较低,这种“错装”机率一般仅约10-6-1

44、0-8,P22噬菌体DNA的包装机制,流产转导:指外基因子未重组到受体菌中的不能稳定转导。,普遍性转导的后果：,稳定转导:指外基因子重组到受体菌基因组中的转导;,（二）特异性转导(restricted transduction),又称局限性转导，所转导的只限于供体菌染色体上特定的基因。,溶原期时，噬菌体DNA整合在细菌染色体特定部位，噬菌体DNA发生偏差分离，将自身的一段DNA留在细菌染色体上，而带走了细菌DNA上两侧的基因。当其转导并整合到受体菌中，使受体菌获得供体菌的某些遗传性状。所转导的只限于供体菌上个别的基因。,普遍性转导与局限性转导的区别,溶原性转换(lysogenic conver

45、sion),当噬菌体感染细菌时，宿主菌染色体中获得了噬菌体的DNA片段，使其成为溶原状态时而致细菌获得新的性状。当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶源转变而获得的性状也同时消失，如白喉棒状杆菌、A群链球菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、霍乱弧菌。,溶源转变与转导有本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带任何供体菌的基因；其次，这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的。,溶源转变与转导的区别,细菌的遗传转化(genetic transformation),定义:同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取,并得到表达的水平方向的基因转移过程。包括自然遗传转化和人工转化两种转化方式。,(

46、1)自然遗传转化,转化现象在细菌中是一种普遍现象。不同细菌转化过程有一定差异，但是它们都存在几个共同特征，即：,感受态指细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。,感受态与感受态因子,感受态因子是影响感受态的一类蛋白质，这类因子可在细菌间转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。,供体(donor)DNA与受体(receptor)细胞结合,结合发生在受体细胞特定部位(结合点),结合过程是一个可逆过程。,对供体DNA片段有一定要求(20000个核苷酸对),DNA摄取,当细菌结合点饱和之后，细菌开始摄取外源DNA；往往只有一条DNA单链进入细胞(单链摄入)，另一条

47、链在膜上降解。,指单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换，从而稳定地掺入到受体DNA中的过程。,与外源DNA片段整合,分泌感受态因子,与细胞表面受体M相互作用,诱导特异蛋白质如自溶素表达,使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性,用CaCl2处理细胞，电穿孔、基因枪法等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高；,(2)人工遗传转化,酵母菌的有性杂交,8.2 真核微

48、生物的基因重组,酿酒酵母的双倍体和单倍体细胞比较,酵母菌结合型的基因重排,盒子模型对结合型互变机制的解释,1、酵母结合型的转变-DNA序列的代换，而不是互换-依赖于序列的同源性（被代换的序列命运是被降解调）,2、同源序列,3、转换过程 内切酶(HO)识别、切割-Y/Z1交界处-起始MAT序列的转换(双链断裂)HM匣子受Sir阻遏蛋白的保护,Y区域被降解，直到Y和Ya相同的部分或一直到X区域,四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对以供体DNA为模板复制Y区域，holliday结构形成,Holliday结构的拆分，产生新的MAT匣子和这次 转换中的供体匣子,4、特征-同源重组和位点特异性

49、重组特征都具有 需要大范围的同源序列 需要重组酶系（rad52基因产物、HO内切酶）,结合型互变的特点：,取代的过程伴随着DNA的复制；,取代只发生在特定的位点，不涉及在DNA中插入一段序列；,结合型的转换具有方向性，受体为MAT一个，而供体有HML和HMR a两个。,结论：这种取代方式为位点专一性重组,构巢曲霉的准性生殖,准性生殖是指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。包括菌丝体联结、异核体的形成、核融合以及体细胞交换和单倍体化。,准性生殖中细胞核的单倍体化,准性生殖与有性生殖的比较,9.工业微生物育种,工业化菌种的要求,能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物;有关合成

50、产物的途径尽可能地简单，或者说菌 种改造的可操作性要强;遗传性能要相对稳定;不易感染它种微生物或噬菌体;产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上 最好与致病菌无关）;生产特性要符合工艺要求.,工业微生物的来源：,索取或向菌种保藏机构购买；自己选育(1)用原有菌株进行遗传改造进行育种 诱变育种 基因重组育种(2)向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育；(3)从自然界中分离菌种 就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。,分离微生物新种的基本步骤：,包括采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。典型的筛选方法(见左图),采样 从自然界种采集含目的菌的样品,环境条件对土样本中微生物分布