微生物知识员工培训.ppt

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1、微生物知识讲座,一、微生物 1.1 微生物基础知识 1.2 微生物的营养和培养基 1.3 微生物的代谢,二、GMP相关微生物知识 2.1 什么是GMP 2.2 GMP对无菌操作方面的要求 三、ICHQ7A相关微生物知识 3.1 什么是ICHQ7A 3.2 ICHQ7A对无菌操作方面的要求,一、微生物基础知识,微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。它们都是一些个体微小（一般0.1mm）、构造简单的低等生物，包括属于原核类的细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体；属于真核类的真菌、原生动物和显微藻类；以及属于非细胞类的病毒和亚病毒。,微生物的分类,原核生物：细菌(狭义的)、放

2、线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体。真核生物：真菌、显微藻类和原生动物等。非细胞微生物：病毒和亚病毒。,原核生物,细菌：细菌(bacteria)是一类细胞细短（直径约0.5um，长约0.5um5um），结构简单、胞壁坚韧、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物。放线菌：放线菌(actinomycetes)是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强的原核生物。,放线菌,放线菌与人类关系极其密切，绝大多数属有益菌。至今已报道过的近万种抗生素中，约70由放线菌产生；本厂生产土霉素的龟裂链霉菌、生产新霉素的弗氏链霉菌、生产阿维菌素的除虫链霉菌（也称阿维链霉菌）都是放线菌的代谢产物。,微生物

3、的染色,为什么要染色 由于细菌细胞既微小又透明，故一般先要经过染色才能作显微镜观察。染色分类 以被染色菌染色后的状态可以分为死菌染色和活菌染色。单染 用一种染色剂的称单染，仅能对细菌形态观察。复染-革兰氏染色 细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G-）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。,1.2微生物的营养和培养基,1.2.1、微生物细胞的化学组成1.2.2、六大营养要素及其生理功能1.2.3、培养

4、基及其组成,1.2.1微生物细胞的化学组成,微生物细胞的化学成分（干物质）以有机物和无机物两种状态存在。有机物包含各种大分子，它们是蛋白质、核酸、类脂和糖类，占细胞干重的99%。无机成分包括小分子无机物和各种离子，占细胞干重的1%。水也是微生物细胞的重要组成成分，通常微生物细胞70%是水。,几种微生物的元素组成（干重%）,1.2.2 微生物的六大营养要素,碳源氮源无机盐能源生长因子水,（一）、碳源（Carbon source）,定义：能提供微生物营养所需碳元素的营养物质称为碳源。功能：提供合成细胞物质及代谢物的原料;并为异养微生物生理活动提供所需要能源。种类:无机含碳化合物（无机碳源）：如CO

5、2和碳酸盐等。有机含碳化合物（有机碳源）：糖与糖的衍生物、脂类、醇类、有机酸、烃类、芳香族化合物以及各种含碳的化合物。,微生物在元素水平上的最适碳源是：CHO型。糖类有机酸类醇类脂类单糖双糖多糖己糖戊糖葡萄糖、果糖甘露糖、半乳糖；纯多糖杂多糖；淀粉纤维素。,微生物工业发酵中用做碳源的原料,传统种类：糖类（糖蜜等）、淀粉（玉米粉、山芋粉、籼米粉、野生植物淀粉等）、麸皮、米糠等。注：糖蜜中主要的糖类物质为蔗糖，蔗糖为非还原糖。,淀粉酶,配料中淀粉必须经常淀粉酶水解方可使用。土霉素生产中所使用的淀粉酶为7658淀粉酶，这是一种淀粉酶，其主要作用于葡萄糖单位的1、4糖苷键。淀粉酶加量并非越多越好，过量

6、使用会使料液中还原糖高，从而光长菌丝不长单位。,还原糖和非还原糖,能够还原斐林(H.von Fehling)试剂的糖称为还原糖，所有的单糖，不论醛糖、酮糖都是还原糖。大部分双糖也是还原糖，蔗糖例外。,葡萄糖效应,。当大肠杆菌培养于含有葡萄糖和乳糖的培养基中，菌体出现两次生长旺盛期，这是菌首先利用葡萄糖进行生长繁殖，在葡萄糖耗尽后，过一段时间菌体才开始利用乳糖。在上述培养基中即使加入乳糖酶诱导物，葡萄糖没耗尽，利用乳糖的酶系也不能合成。碳分解产物的阻抑作用普遍存在于微生物的生化代谢中。,速效碳源与迟效碳源,葡萄糖是速效碳源，加入培养基后，菌体迅速利用。淀粉等是迟效碳源，需要等葡萄糖消耗到一定浓度

7、以下才开始利用。淀粉的利用方式是通过分泌到胞外的淀粉酶将淀粉水解成小分子的葡萄糖以后，才可以利用。速效碳源有利于菌体生长，迟效碳源有利于产物生成。在抗生素生产的中后期，加入过量的葡萄糖，菌体会立刻停止产抗生素，转入二次生长。,（二）氮源（Nitrogen source）,定义：凡用来构成菌体物质或代谢产物中氮素来源的营养源。种类：无机氮源：铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、氨、N2等；有机氮源：蛋白质及其降解产物（如胨、肽、尿素、氨基酸等）、牛肉膏、鱼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆等。功能：1）提供合成细胞中含氮物，如蛋白质、核酸以及含氮代谢物等的原料；2）少数细菌可以铵盐、硝酸盐等氮源为能源。,培养基

8、中氮源的利用,蛋白氮必须通过水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用，这种氮源叫迟效氮源。无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源。速效氮源，通常有利于机体的生长，迟效氮源有利于代谢产物的形成。玉米浆是速效氮源，利于菌体生长；花生饼粉和黄豆饼粉是迟效氮源，利于代谢产物积累。微生物对铵盐和硝酸盐类氮源利用能力强，可直接吸收利用，是速效氮源。,生理酸性盐和生理碱性盐,铵阻遏,铵分解产物的调节作用指的是被菌体迅速利用的氮源（特别是铵）能阻抑某些参与含氮化合物代谢的酶的合成。与葡萄糖效应较为相似，在土霉素生产中，氨水与玉米浆的流加速度要适量，否则会影

9、响抗生素的合成。,豆粉的制作及分类,发酵培养基中经常会用到豆粉作为氮源，常见的如高温豆粉，低温豆粉等。豆子豆粉的生产主要如下：先将豆子压榨出油，（根据客户对残留脂肪含量的要求不同），可以压榨一次、二次甚至三次（压榨次数越多，残留脂肪含量就越少），再对豆饼进行炒制，最后进行磨粉，这些豆粉的在制作工艺上区别主要在于豆饼炒制温度不同和达到炒制要求温度后豆饼维持温度时间的长短差异。经过高温炒制等物理过程后，细胞膜上的磷脂双分子层、ATP等大分子断裂后，形成磷酸根形式就可以检测出来了。,（三）无机盐（inorganic salt）,定义：为微生物细胞生长提供碳、氮源以外的多种重要元素（包括大量元素和微量

10、元素）的物质，多以无机盐的形式供给。大量元素：生长所需浓度在103104mol/L范围内。如：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等。微量元素：生长所需浓度在106108 mol/L范围内。如：Cu、Zn、Mn、Mo和Co、Ni、Se、Sn等。一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。,磷,以土霉素为例，培养中溶磷含量对菌体和效价单位有着相当大的影响。在种子和发酵培养基中，溶磷主要存在于3种组份：玉米浆、高温豆饼粉、磷酸二氢钾。注：豆饼粉中的溶磷在炒制过程中，一部分分解为小分子物质，可以被检测出来。另一部分仍以各种有机大分子的形式存在，无法测

11、量。,培养基中溶磷的计算与实际测量：,豆粉中磷含量=豆粉(配比g/ml)含量(ug/g)高温黄豆饼粉磷含量参考值：2600ug/g玉米浆磷含量=玉米浆(配比g/ml)含量(ug/g)玉米浆干物质磷含量的参考值：12000ug/g 磷酸二氢钾中磷含量=227941配比(g/ml)培养基中磷的总量(ug/ml)=+土霉素发酵培养基：理论计算，溶磷116，生化测定为92.6。,磷酸盐调节,磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节次级代谢产物生物合成的重要因素。过量的磷酸盐也象葡萄糖一样抑制次级代谢产物的合成，这种抑制作用被称为磷酸盐调节。在发酵生产过程中（以土霉素为例），补入磷源后，尾气中

12、CO2升高，活菌数升高。但补入过多，会使生长转入初级代谢，从而影响效价增长。筛选耐受高磷酸盐的生产用菌株，对于生产会有很大的帮助作用（例如在补料过程）。,生长因子,生长因子一类微生物生命活动过程中调节微生物正常代谢所必需、需要量不大的、但不能用简单的碳源或氮源自身合成的有机营养物。广义生长因子维生素、卟啉、碱基、氨基酸、嘌呤、嘧啶及其衍生物、C4C6脂肪酸、营养缺陷型氨基酸狭义生长因子维生素生长因子来源酵母膏（yeast extract）、牛肉膏（beef extract）、麦芽汁（malt extract）、玉米浆（cornsteep liquor）、蔬菜汁、麸皮、米糠等。,水,1）溶剂和运

13、输介质，营养物质吸收及代谢物分泌2）参与细胞内的生化反应3）维持蛋白质、核酸稳定天然构象4）热的良好导体，控制细胞内温度变化5）维持细胞自身正常形态6）控制酶、微管、鞭毛等多亚基结构组装和解离,1.2.3 培养基（medium）,定义：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质（混合养料）。用途：促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品。任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，且应比例适当！培养基一旦配成必须立即灭菌。,培养基的选择,培养基的应用目的：是培养菌体还是积累代谢产物？是实验

14、室种子培养还是大规模发酵？代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？用于种子培养的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）；用于大量生产代谢产物的培养基：氮源一般应比种子培养基稍低（若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）；大规模发酵用的培养基，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉的原料，提倡以粗代精，以废代好。,营养协调,培养基中营养物质的浓度 浓度过高微生物的生长起抑制作用，浓度过小不能满足微生物生长的需要。各营养物质之间的比例 各营养要素之间比例（10倍递减规律）H20C+能源N源P、SK、Mg生长因子 10-1 10-2 10-3 10-4 10-

15、5 10-6碳氮比（C/N）:直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累，故常作为考察培养基组成时的一个重要指标；速效性氮（或碳）源与迟效性氮（或碳）源的比例。,碳氮比（C/N）,培养基分类,用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）；用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）；若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否加入特殊元素或特定的代谢产物；当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉的原料，提倡以粗代精，以废代好。,影响种子质量的因素,一、原材料

16、质量：如四环素、土霉素生产中配制孢子培养基的麸皮、琼脂的牌号等。原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同，如微量元素Mg、Ca、Ba能刺激孢子的形成。P含量的多少也影响种子的质量。二、培养条件：温度、pH值、湿度、培养时间和冷藏时间都影响种子质量。,如土霉素生产菌种龟裂链霉菌的孢子，在北方干燥地区孢子斜面长的快，在含少量水分的试管斜面培养基中下部孢子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。据资料记载，土霉素一般相对湿度4045时孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好。,培养基的pH值,各类微生物的最适生长pH值各不相同 细 菌：

17、7.08.0 放线菌：7.58.5 酵母菌：3.86.0 霉 菌：4.05.8在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，培养基的初始pH值会发生改变。pH值调节方式内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐调节培养基的pH值（最常见的如CaCO3）。外源调节：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液（如土霉素生产中流加氨水调节pH值变化）。,微生物的生命活动对环境pH值的影响,配制培养基时应注意的几个问题及解决方法,混浊和沉淀胶体强度的破坏褐色物质的形成pH发生变化泡沫,可能与培养基中含有2价、3价金属离子和可溶性磷酸盐有关（加螯合剂）pH值降到4.5以下，琼脂固体

18、培养基灭菌后，琼脂被热水解而不再凝固，或凝固不坚还原糖类、蛋白质与氨基酸在高压、高温下相互作用的结果，“焦化”或美拉德反应灭菌后pH会降低（糖分在高温下分解为小分子的酸性物质），在培养基灭菌前后加以调整加入消泡剂，适当提高灭菌温度或延长灭菌时间,美拉德反应：即葡萄糖与氨基酸所发生的系列化学反应而产生的产物（如氨基糖）。,小知识-轻钙与重钙,轻钙：又称为沉淀碳酸钙、沉降碳酸钙轻质超细碳酸钙，俗称轻钙。是将石灰石等原料段烧生成石灰和二氧化碳，再加水消化石灰生成石灰乳（主要成分氢氧化钙），通入二氧化碳碳化石灰乳生成碳酸钙沉淀，经脱水、干燥和粉碎制得。重钙：就是方解石粉，是“重质碳酸钙”的简称，是矿石

19、粉天然粉碎制的。,1.3 微生物的代谢,1.3.1 微生物的能量代谢1.3.2 分解代谢和合成代谢的联系1.3.3 微生物的代谢调节与发酵生产,代谢概论新陈代谢(metabolism)：简称代谢,是细胞内发生的各种化学反应的总称。分解代谢合成代谢,分解代谢（catabolism）分解代谢：指细胞将大分子物质降解成简单的小分子物质并产生能量的过程。1)多糖 单糖 丙酮酸/乙酰辅酶A CO2，H20，能量（三羧酸循环）2)蛋白质 氨基酸3)脂类 甘油，脂肪酸,合成代谢（anabolism）合成代谢：指细胞利用小分子物质合成复 杂大分子并消耗能量的过程。合成代谢所利用的小分子物质来源于分解代谢过程中

20、产生的中间产物或环境中的小分子营养物质。,生物氧化及产能,生物氧化：就是发生在活细胞内的一系列产能性氧化反应的总称。氧化过程中能产生大量的能量，分段释放，并以高能键形式贮藏在ATP分子内，供需要时使用。底物氧化脱氢的四条主要途径：EMP途径、HMP途径、ED途径、TCA循环。前三种途径是生物体将葡萄糖氧化成丙酮酸和其它小分子物质，TCA循环是将丙酮酸彻底氧化成CO2和H2O并释放出能量。,据某些资料说添加微量的硫氰化苄可以抑制或者减弱TCA呼吸，从而使乙酰CoA更多的转向次级代谢，从而提高土霉素产量。,初级代谢与初级代谢产物,初级代谢：能使营养物质转变成结构物质、对机体具有生理活性作用的物质或

21、为机体生长提供能量的一类代谢。初级代谢产物：包括代机体进行生物合成的各种小分子前体物、单体、多聚体以及在能量代谢和代谢调节中起作用的各种物质。,次级代谢与次级代谢产物,次级代谢：存在于某些生物中并在它们一定生长时期内出现的一类代谢类型。次级代谢产物：次级代谢的产物为次级代谢产物。是指某些微生物生长到稳定期前后，以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初级代谢物作前体，通过复杂的次级代谢途径合成的结构复杂的化学物。次级代谢产物一般具有结构复杂、代谢途径独特、在生长后期合成、产量较低、生理功能不很明确，其合成一般受质粒控制等特点。,土霉素的生物合成,生物合成见复印纸。土霉素的一些性质：可以和铁离子形成

22、 红色络合物。可以和铝离子形成 黄色络合物。可以与钙离子形成不溶性的钙盐，从而减少产物抑制。培养基中碳酸钙的另一种用途。,阿维菌素的生物合成,新霉素的生物合成,二、GMP相关微生物知识,原料药的发酵生产过程应采取有效措施，避免微生物的污染。1、需接种、转种或无菌添加培养基、缓冲液和气体的，应尽可能采用闭口或密闭的系统。如果接种、转种或加料（培养基、缓冲液）需在容器敞口时进行，应有相应控制措施，将污染的风险降到最小。,2、原料药质量存在微生物污染风险时，容器敞口的操作应在生物安全柜中或者类似的控制环境中进行。3、操作人员应穿适宜的无菌工作服，并采取相应措施处理培养物。4、关键操作参数（如温度、p

23、H、搅拌速度、通气量、压力）应予监控，确保与生产工艺规程一致。5、对菌体生长、活性、繁殖速率（必要时）也应予监控。,6、非关键参数可不予监控。7、发酵设备使用后应清洗、消毒或灭菌。8、发酵用培养基必要时应在使用前灭菌。9、发酵生产中应建立染菌处理程序，并保存污染的处理记录。应有合适的程序来检测染菌，并决定纠偏措施。处理程序应包括确定污染对产品质量的影响、去除设备和系统中的污染并恢复到正常状态的方法。应根据需要，对发酵过程检出的外来微生物进行，并对影响产品质量的后果进行评估。在处理产出的外来微生物应结合考虑以上的各种情况。,10、应保存污染及处理的完整记录。11、在品种更换时，对公用设备进行清洁

24、后，必要时需进行额外检测，以便将交叉污染的风险降到最小。,三、ICHQ7A,什么是ICHQ7A InternationalConferenceon Harmonization 人用药注册技术要求国际协调会。2000年11月在EMEA公布网站上公告。为2001年7月欧盟GMP指南的附件18公布。世界卫生组织目前正在审查指南来决定是否应当采用Q7A并将之提升为国际标准以实现全球统一。,Q7A涵盖范围,工作细胞库的维护正确接种和生长发酵期间关键操作参数的控制细胞生长过程、存活力和生产率的监控放罐/后续纯化过程：细胞及培养基的除去。生产相应阶段：微生物限量和内毒素控制产生的杂质、污染物的除去,细胞库维护和记录 授权人员主可进入细胞库 贮存条件：保持细胞活力，防止污染 砂土管使用和储存记录的保存 细胞库的定期监控：确定适用性细胞发酵 无菌条件下接种/移种的环境及系统控制 严格按规程、规定执行。减少污染。处理培养菌的操作人员：适当着装/特殊防护,关键操作参数：保证工艺一致性 温度、pH、搅拌速度、通气量、压力等。细胞生长情况。培养基/设备的清洗、灭菌。,附：土霉素生产中一些参数的变化（此图的分析详见VB12课件）,谢谢,