微生物分类与鉴定.ppt

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1、微生物的分类和鉴定,地球上的物种估计大约有150万，其中微生物超过10万种，而且其数目还在不断增加。,生物分类的二种基本原则：,a）根据表型(phenetic)特征的相似程度分群归类，这种 表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生 物亲缘关系为目标。,b）按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标 是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系 统发育的分类系统。,从进化论诞生以来，已经成生物学家普遍接受的分类原则,生物系统学(systematics),章节内容,第一节 通用分类单元系统分类单元、种的概念、学名、亚种第二节 微生物在生物界的地位生物界级分类学说、五界系统、三域学说及其发展、

2、微生物的进化第三节 各大类微生物的分类系统纲要原核微生物分类系统纲要、真菌的分类系统纲要第四节 微生物的鉴定经典分类鉴定方法、现代分类鉴定方法。,第一节 通用分类单元,分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、研究和利用各种微生物资源也必须对它们进行分类。,分类学涉及三个相互依存又有区别的组成部分：,鉴定,分类、,命名、,命名(nomenclature)：是根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称；,鉴定(identification或determination)：借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。,分类(cl

3、assification)：根据一定的原则对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定；,一、分类单元及其等级,界（Kingdom）(Regnum),门（Phylum）(Phylum),纲（Class）(Classis),目（Order）(Ordo),科（Family）(Familia),属（Genus）(Genus),种（Species）(Species),根据Carl Woese的理论，现在还在界之上使用域(domain),（把全部生物先分为古生菌域、细菌域和真核生物域，域下面再分界。）,常用的细菌分类学术语：,

4、1）培养物(culture)：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长 物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。,2）菌株(strain)：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法(如通过诱变)所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。,Bacillus subtilisASI.398,Bacillus subtilisBF7658,生产蛋白酶,生产淀粉酶,3）型(form或type)：常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。,例如抗原特征的差异分为不同的血清型；

5、对噬菌体裂解反应的不同分为不同的噬菌型等,4）种（species）：物种，生物分类中基本的分类单元,高等生物中，“生殖隔离”被看作是区分物种的标准,微生物的种：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其 他类群的菌株有很明显的区别。,菌株与型的区别：菌株之间不存在鉴别性特征的差异，命名不同的菌株无需分类学依据，不同型的细菌之间存在鉴别性特征的差异，命名或鉴定不同的型必需有分类学依据。,二、微生物的命名,双名法，由二个拉丁字或希腊字或拉丁化了的其它文字组成，一般用斜体表示,属名在前，一般用拉丁字名词表示，字首字母大写,种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写,若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定到

6、种，可用sp来表示，,例如 Bacillus sp,由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准，为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱，细菌系统分类也像其他生物分类一样采用“模式概念”,种和亚种指定模式菌株（type strain）；,亚属和属指定模式种（type species）；,属以上至目级分类单元指定模式属（type genus）；,模式菌株应送交菌种保藏机构保藏，以便备查考和索取。,第二节 微生物在生物界的地位,一、生物的界级分类学说,利用16SrRNA建立分子进化树的美国科学家 Carl Woese,二、三域学说及其发展,三、rRNA和系统发育树,1.rRNA的顺序和

7、进化,培养微生物,提取并纯化rRNA,rRNA序列测定,分析比较,微生物之间的系统发育关系,2.特征序列或序列印记（signature sequence）,通过对r RNA全序列资料的分析比较（特别是采用计算机）发现的在不同种群水平上的特异特征性寡核苷酸序列，或在某些特定的序列位点上出现的单碱基印记。,特征序列有助于迅速确定某种微生物的分类归属，或建立新的分类单位。,3.系统发育树(phylogenetic tree),通过比较生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为分子系统树，其特点是用一种树状分枝的图型来概括各种(类)生物之间的亲缘关系。,16 S r RNA系统发育树,1）生命的第三种形

8、式古生菌,动物界和植物界,原核生物和真核生物（20世纪60年代）,古细菌(archaebacteria)真细菌(Eubacteria)真核生物(Eukaryotes),（1977，Carl Woese）,Bacteria(细菌)Archaea(古生菌)Eukarya(真核生物),（1990，Carl Woese）,原核生物,界（Kingdom）,域（domain）,2）建立16 S r RNA系统发育树的意义,a）使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群；,传统生物进化研究主要基于复杂的形态学和化石记载，因此多限于研究后生生物，而后者仅占整个生物进化历程的1/5,b）提出了一种全新的正确衡量生

9、物间系统发育关系的方法；,c）对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据；,d）突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立了全 新的分类理论；,e）为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理 论和研究方法，特别是不经培养直接对生态环境中的微生物进 行研究。,不可培养微生物（uncultured microorganisms）,从环境中直接分离并克隆rRNA并分析其序列和在分子进化树上的位置等方法而发现的的目前尚不能在人工条件下获得培养的微生物。,不可培养的微生物与生物多样性,3）三（界)域生物的主要特征,三界理论虽然是根据16SrRNA序列的比较提出的，但其他特

10、征的比较研究结果也在一定程度上支持了三界生物的划分。,随着越来越多的微生物的全基因组序列的测定，人们发现生物在进化中存在着非常广泛的水平基因转移现象，很多科学家都认为不能仅靠对16SrRNA的序列比较来确定生物之间的亲缘关系，还必须借助各种信息对这个进化树进行改进。,Carl Woose的rRNA进化树完美无缺？,一项新的研究指出，在我们体内的每个细胞中有 40 个左右的细菌基因，这个由细菌到人类寄主的所谓的“横向转移(lateral transfer)”给进化生物学带来了极大的问题。,2001年5月18日 美国科学周刊292卷 第5520期,人类基因组中的细菌基因？,第三节 各大类微生物的分

11、类系统纲要,二、真菌（菌物）分类系统简介,一、原核微生物分类系统,一、原核微生物分类系统,（一）伯杰氏鉴定细菌学手册(Bergeys Manual of Determinative Bacteriology),美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937),伯杰氏手册:是目前进行细菌分类、鉴定的最重要参考书，其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方法。,1923年以来已出至第九版(1994)；第九版伯杰氏细菌鉴定手册设立35个群，将古细菌部改编为5个群，全书描写了约500个属。划分为四大类：第一类 具细胞壁的革兰氏阴性真细菌 第

12、二类 具细胞壁的革兰氏阳性真细菌 第三类 无细胞壁的真细菌 第四类 古细菌,伯杰氏细菌鉴定手册,（二）伯杰氏系统细菌学手册(Bergeys Manual of Systematic Bacteriology),第一版 1984年问世，至1989年出齐，共4卷。第二版 由George Garrity主编分为5卷，将从2000年起陆续出版。这一版纳入了研究核糖体RNA测序所产生的许发育)分类系统。,伯杰氏系统细菌学手册第二版,分古细菌和真细菌2个界，下设18门、27纲、73目、186科，包括870余属和4900多个种。,界：古细菌(Archaeota)部1：热变形菌、硫化叶菌、嗜压菌(Thermo

13、protei、Sulfolobi、Barophiles，21属36种)部2：产甲烷菌(Methanogens，21属97种)部3：盐杆菌(Halobacteria，14属50种)部4：热原体(Thermoplasma，2属4种)部5：热球菌(Thermococci，5属19种),界：真细菌(Bacteria)部6：产液菌(Aquifex)和相关细菌(3属5种)部7：栖热袍菌(Thermotoga)和Geotogas，9属22种)部8：异常球菌(Deinococci，1属8种)部9：栖热菌和归属不明的属(Thermi，10属21种)部10：产菌黄(Chrysiongenes,1属2种)部11：绿

14、屈挠菌和滑柱菌(Chloroflexi和Herpetosiphons，5属11种),界：真细菌(Bacteria)部12：热微菌(Thermomicrobia,1属2种)部13：蓝细菌(Cyanobacteria，69属73种)部14：绿菌(Chlorobia，6属17种)部15：-变形细菌(-Proteobacteria，117属392种)部16：-变形细菌(-Proteobacteria，53属204种),界：真细菌(Bacteria)部17：-变形细菌(-Proteobacteria，150属854种)部18：-变形细菌(-Proteobacteria，39属128种)部19：-变形细菌

15、(-Proteobacteria，6属56种)部20：梭菌(Clostridia)和相关细菌(73属403种)部21：柔膜菌(Mollicutes，10属191种)部22：芽胞杆菌和乳杆菌(Bacilli和Lactobacilli，55属535种),界：真细菌(Bacteria)部23：放线细菌(Actinobacteria，117属，1371种)部24：浮霉状菌和衣原体(Planctomycetes和Chlamydia，5属14种)部26：丝状杆菌(Fibrobacters，3属5种)部27：拟杆菌(Bacteroides，20属130种),界：真细菌(Bacteria)部28：黄杆菌(Fl

16、avobacteria，15属72种)部29：鞘氨醇杆菌(Sphingobacteria，22属76训)部30：梭形菌(Fusoforms，6属29种)部31：疣微菌和相关细菌(Verrucomicrobium，2属5种),二 真菌（菌物）分类系统简介,Ainsworth et al(1973)V.Arx(1981)真菌字典（1983）Kendrick(1992)真菌字典（1995）Alexopoulos&Mins(1996),黏菌门：黏菌纲 根肿菌纲真菌门：鞭毛菌亚门：壶菌纲 丝壶菌纲 卵菌纲接合菌亚门：接合菌纲 毛菌纲子囊菌亚门：半子囊菌纲 不整囊菌纲 核菌纲 盘菌纲 腔菌纲 虫囊菌纲担子

17、菌亚门：冬孢菌纲 层菌纲 腹菌纲半知菌亚门：芽孢纲 丝孢纲 腔孢纲,真 菌 界（1995）,第四节 微生物分类鉴定的方法,生物分类的传统指标,分子生物学指标,微型、简便、快速或自动化鉴定技术,细菌的数值分类,形态学特征,生理学特征,生态学特征,从不同层次，用不同学科的技术方法来研究和比较不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的反映微生物类群特征的资料。,生物分类的传统指标,一、形态学特征,培养特征、,运动性、,特殊的细胞结构、,细胞形态及其染色特性、,等等,微生物分类和鉴定的重要依据之一：,a）易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊 形态结构的细菌；,b）许多形态学特征依赖于多基因

18、的表达，具有相对 的稳定性；,二、生理生化特征,与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关；,代谢产物等,营养类型；,与氧的关系；,对温度的适应性；,对pH的适应性；,对渗透压的适应性；,酶及蛋白质都是基因产物；,对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较；,测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多；,1、API 细菌数值鉴定系统2、Enterotube 系统3、Biolog 全自动或手动细菌鉴定系统,微型、简便、快速或自动化鉴定技术,1、API 细菌数值鉴定系统,菌种,基本培养基（液体）,菌悬液,检测、编码、查表、鉴定,适用于API鉴定细菌有700多种,Analytica P

19、roducts INC的简称。法国生物-梅里埃公司生产的细菌数值分类分析鉴定系统。约有1 000 种生化反应,可鉴定的细菌大于550 种。目前中国各级疾病预防控制机构在细菌学检验中比较多地应用了此项技术,2、Enterotube 系统,不同培养基分装不同小槽中，同步接种，培养后检测、查表、鉴定。,3、Biolog全自动或手动细菌鉴定系统,在96孔的细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。,自动化、快速,可鉴定细菌有1140多种、酵母菌267种、目前已经可用于丝状真菌。,每个孔中含有不同的底物,菌悬液或无菌水,分子生物学指标,DNA碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个

20、别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。,1.DNA的碱基组成(G+Cmol%),分类学上，用G+C占全部碱基的克分子百分数(G+Cmol%)来表示各类生物的DNA碱基因组成特征。,每个生物种都有特定的GC%范围，因此 可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25-75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。,GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌 作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。,G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定,但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。,同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在45%以下；同属不

21、同种的差别应低于1015%；G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。,若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。,2.核酸的分子杂交,不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近，反之亦然。,直接分析比较DNA的碱基排列顺序,-由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；,核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生物DNA,碱基排列顺序的相似性,1）DNA-DNA杂交；,（亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较）,2）DNA-rRNA杂交；,（亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘关系比较）,3）核酸探针；,（利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定）,4）电子杂交,随着微生物基因信息，特别是全基因组完全测序的不断增加，我们可以通过各种计算机软件对不同物种的遗传信息进行直接比较，从而分析不同微生物间的亲缘关系。,3、其它,血清学试验噬菌体分型生态特性氨基酸顺序蛋白质分析细胞壁等细胞成分,通过原核生物的转化、转导、接合来判断原核生物的亲缘关系等等。,