应用高效液相色谱法进行血红蛋白分析.ppt

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1、1,应用高效液相色谱法进行血红蛋白分析,血液室 颜慕霞,2,地中海贫血及异常血红蛋白病知识简介,一、地中海贫血综合征（地贫）是指因遗 传的缺陷，血红蛋白中的一种或几种 珠蛋白肽链的合成受到抑制，但珠蛋 白肽链的分子结构并无异常的一种单 基因遗传病。,3,二、异常血红蛋白病,异常血红蛋白则是指那些由于遗传上的 缺陷，导致珠蛋白分子结构异常的血红 蛋白。由于异常血红蛋白导致溶血性贫 血等临床表现，叫做异常血红蛋白病。异常血红蛋白病与地贫常并存于同一个患者称为异常血红蛋白病合并地贫。,4,血红蛋白的组成,由一个珠蛋白分子和四个亚铁血红素结 合而成。每一个珠蛋白分子皆有两种不同的珠蛋 白肽链双结合构成

2、一种Hb的类型。人类主要有以下四种珠蛋白肽链：、和,5,地贫和异常血红蛋白病的发生,当控制珠蛋白链合成的珠蛋白基因发生 突变或缺失，就使相应的珠蛋白链合成 减少或 完全不能合成，导致Hb合成异 常，就出现了异常Hb病或地贫。,6,正常的三种血红蛋白,HbA:22 HbA2:2 2HbF:2 2,7,正常三种血红蛋白珠蛋白肽链的构成,2 2 2 2 HbA HbA2 HbF(22)(2 2)(2 2),8,地贫的类型,根据所缺乏的珠蛋白肽链进行分类，链，链或链合成缺乏或缓慢者，分 别被称为地贫，地贫，或地贫。和或和链合成都减少或缓慢者 分别称为或地贫。,9,地贫,轻型：静止型 标准型 可见Hb

3、Barts（4）中间型：血红蛋白H病（4）重型：血红蛋白Barts病,10,链结构异常产生的血红蛋白,血红蛋白Constant Spring（HbCS)链的羧基端后多出31个氨基酸血红蛋白QS 碱基突变非缺失型HbH病血红蛋白Q(74天AA变组AA),11,地贫,轻型：重型：中间型：当控制链的基因发生突变或缺失时，链减少，多余的链将与、链形成HbA2和HbF，所以地贫时HbA2和HbF均有不同程度的增高。,12,链结构异常产生的血红蛋白,HbE（2226谷 赖）HbS（226谷 颉）HbC（226谷 赖）,13,常用检测地贫及异常血红蛋白病方法,血常规是检测地贫及异常血红蛋白病最基本的实验之一

4、。血红蛋白电泳是检查地贫与异常血红蛋白病最主要及最常用的实验诊断方法。高效液相色谱法。地贫的基因诊断。,14,血常规,6个基本参数：RBC，Hb，HCT，MCV，MCH，MCHC。MCV明显降低是地贫的首选筛查指标，通常MCV80fl，MCH25pg。红细胞形态：小细胞低色素改变为主，异形性明显,15,正常红细胞：圆盘状，双面凹陷。,16,红细胞形态异常：可见靶形红细胞，泪滴形红细胞，环形红细胞，红细胞碎片，红细胞大小不等。,17,红细胞形态异常：可见靶形红细胞，泪滴形红细胞，环形红细胞，盔形红细胞，红细胞碎片，红细胞大小不等。,18,红细胞形态异常：可见环形红细胞，棘形红细胞，红细胞碎片，红

5、细胞大小不等。,19,红细胞形态异常：可见半岛形红细胞，锯齿形红细胞，环形红细胞，红细胞碎片，红细胞大小不等。,20,红细胞形态异常：可见棘形红细胞，泪滴形红细胞，靶形红细胞，环形红细胞，半岛形红细胞，红细胞大小不等。,21,中性粒细胞：中幼粒、分叶核细胞。,22,早幼粒细胞及中性杆状细胞。,23,血红蛋白分析,电泳：血红蛋白电泳是检查地贫与异常血红蛋白病最主要及最常用的实验诊断方法。我院检验科血液室自从80年代初即开展以醋酸纤维素为介质的血红蛋白电泳实验诊断地贫与异常血红蛋白病。,24,血红蛋白电泳仪,于1998年购入一台美国海伦娜公司的 REP全自动凝胶电泳仪取代手工电泳进 行地贫与异常血

6、红蛋白的检测，使电泳 结果更加准确，很好地支持了临床医生 对此二种疾病的诊断。,25,血红蛋白电泳仪,但是电泳的价值受到一定的限制，因为 有一些异常血红蛋白的电荷改变极微或 没有改变，在电泳时它们不能被查出，会造成临床上的漏诊，同时由于电泳对 各种血红蛋白成分的定量不够标准化，经常会给结果的判断造成困难,26,地贫的基因诊断,地贫基因诊断试剂盒可同时检测中国 人中常见的三种缺失型地贫，即东南亚缺失型（SEA），左侧缺失型（4.2），右侧缺失型（3.7）。并且还可检出临床上无症状的静止型 地贫。,27,地贫的基因诊断,地贫基因诊断试剂盒可对17个常见 珠蛋白基因突变位点行检测，结果易于 判定。,

7、28,地贫的基因诊断,但地贫基因分析不能检测异常血红蛋白病，对临床上异常血红蛋白病有漏诊的情况发生，而且价格昂贵，不适于大量大面积筛查。,29,高效液相色谱法,检验科血液室2007年购入一台美国伯乐公司出产的VARIAN高效液相色谱仪。高效液相色谱法是国际上公认的HbA2与HbF定量的标准方法。是一种灵敏的、特异性强的、重复性高的电泳替代方法。,30,VARIANTTM 血红蛋白测试仪,31,高效液相色谱法原理,色谱法是一种以物理化学原理为主的分离分析方法，色谱法分离率高，可以把理化性质相差不大的混合物通过简单的分离技术，使微小差异的各组成分通过几百次甚至几千次的重复累积为大的差异而达到分离。

8、在分离的同时，根据出峰位置可以定性，根据峰面积可以定量。灵敏度高，选择性高，特别适用于生物大分子如各种血红蛋白组分的分离。,32,HPLC在医院临床中的应用,治疗药物监测和药代动力学临床诊断：血红蛋白分析,33,高效液相色谱法血红蛋白分析操作,静脉血2ml，EDTA-K2抗凝经定标、质控，标本直接上机，通过电脑操作，便能实现Hb析出、检测、定量的过程。,34,高效液相色谱法的优点,快速高效：6min自动化程度高：直接上机，无需前处理。方便、节省：可单份样本，亦可大批量高稳定性和高精密度：批内与批间变异系数小准确率高检测结果易于判断：数据和图形,35,检测结果,可对血红蛋白组分中的HbA2、Hb

9、F准确定量，对地贫作出比电泳更为准确的诊断。同时还可检测到HbBarts以及HbH，提示患儿有地贫。色谱仪可对地贫基因分析无法查出的多种异常血红蛋白病作出诊断。,36,正常样本,37,-地中海贫血（轻型）,38,缺失型 HbH病(HbH出峰时间0.47分钟，峰值13.5%。HbF出峰时间1.08分钟，峰值0.3%。HbA出峰时间2.54分钟，峰值81.9%。HbA2出峰时间3.60分钟，峰值1.8%。),39,HbCS复合HbH病(HbH出峰时间0.47分钟，峰值13.5%。HbF出峰时间1.12分钟，峰值1.4%。HbA出峰时间2.48分钟，峰值82.1%.HbA2出峰时间3.61分钟，峰值0.9%。HbCS出峰时间5.03分钟，峰值0.9%。),40,41,HbS峰，镰形红细胞贫血病,42,血红蛋白E 峰,HbE病,43,血红蛋白C病,44,总结,全球约1.5亿人携带地贫基因，已发现的地贫基因突变类型至少有81种，和地贫基因突变类型至少有186种。,45,总结,HPLC对地贫作出准确的诊断，检测到HbBarts以及HbH，提示患儿有地贫，对地贫基因分析无法查出的多种异常血红蛋白病作出诊断。HPLC费用低廉，结果快速准确。目前HPLC是地贫非基因检测手段中最经典的方法,46,谢谢。,