犬小孢子菌PPT.ppt

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1、犬小孢子菌SSH文库中差异基因的研究,硕士研究生：张渊指 导 教 师：杨国玲 教授专 业 名 称：皮肤病与性病,前 言,犬小孢子菌主要侵犯儿童引起白癣、脓癣和体癣儿童头癣48%,儿童体癣36%成人头体癣16%,研究背景,1.儿童皮脂腺发育不完全 2.犬小孢子菌蛋白酶的作用,犬小孢子菌儿童头癣发病机制,推测儿童头皮是否诱导犬小孢子菌毒力因子,？,材 料,前期试验克隆：菌液PCR，菌液克隆 主要试剂：1.DIG High Prime Labeling&Detection Starter Kit I 2.杂交膜 3.Real time PCR Kit 主要仪器：1.CL1000紫外交联仪（UVP）2

2、.Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System,儿童头皮培养菌株(tester),儿童光滑皮肤培养菌株(driver1),成人头皮组织培养菌株(driver2),斑点杂交实时PCR,技术路线,获得差异基因,前期完成试验,消减文库,SSH,方法-斑点杂交,正反向消减文库PCR扩增,制备探针,酶切回收,杂交膜,DIG-High Primer,探针,菌液PCR产物,阳性克隆测序,阳性克隆菌液送大连宝生物测序：菌种为DH10B，载体为PMD-T18 测序使用引物为：F Primer（M13-47）；R Primer（RV-M）,测序分析,序列预处理,去除混杂

3、基因,同源性比对,功能分类,实时PCR,TestermRNA,Driver1mRNA,Driver2mRNA,2个基因,2个基因,18S rRNA,3个RNA池均为构建消减文库时保存的总RNA,探针引物序列,结 果消减文库酶切前后结果,结 果-斑点杂交,消减文库1斑点杂交部分结果,正向 反向,正向,反向,消减文库2斑点杂交部分结果,结 果-斑点杂交,阳性克隆测序及分析,共得到106个有效序列,共得到13个ESTs,8个ESTs找到了同源基因,6个同源基因具有功能分类,消减文库1差异基因比对结果,消减文库2差异基因比对结果,蛋白功能分类,实时PCR-18s rRNA,18s rRNA基因在3个R

4、NA池中的实时PCR表达情况,FSH1基因在tester RNA池和driver 1 RNA池中的实时PCR表达情况,实时PCR-FSH1,PQ-LRP基因在tester RNA和driver 1 RNA池中的实时PCR表达情况,实时PCR-PQ-LRP,P-GAL4基因在tester RNA池和driver 2 RNA池中的实时PCR表达情况,实时PCR-P-GAL4,NADH1基因在tester RNA池和driver 2 RNA池中的实时PCR表达情况,实时PCR-NADH1,4个ESTs表达的相对表达倍数关系,讨 论,犬小孢子菌致病因子表达,犬小孢子菌主要致儿童头癣,儿童头皮组织结构蛋

5、白差异,利用SSH,可能影响,讨 论,Tester和driver作为探针,低丰度基因的丢失,正反向消减DNA作为探针,避免低丰度基因的丢失高背景，阳性率降低,去掉接头,降低背景，筛选差异基因,讨 论,儿童头皮培养菌株,儿童光滑皮肤培养菌株,构建文库富集差异基因,成人头皮培养菌株,讨 论,讨 论-FSH1,目前对FSH1的研究主要是对其结构的分析FSH1是酯酶，水解疏水磷酸酯、油酯化合物 FSH家族功能较多：蛋白酶作用、调控因子作用等FSH1在此发挥蛋白酶作用还是调控因子作用还不清楚,Sophie Quevillpn-cheruel,讨 论-PQ-LRP,PQ-LRP蛋白是膜绑定蛋白，拥有一对重

6、复的环结构（环1和环2）环2对半胱氨酸载体定位于溶酶体至关重要 半胱氨酸载体调控半胱氨酸代谢PQ-LRP基因的上调表达，可能与半胱氨酸的代谢增强有关 PQ-LRP基因可能是犬小孢子菌的重要致病因子,讨 论-NADH1,NADH1是呼吸链的组成部分，参与ATP的生成犬小孢子菌ATP利用率的增加，可能与其在儿童头皮组织中生长更活跃有关,讨 论-P-GAL4,P-GAL4基因属于GAL4家族，含有一个真菌中独有的GAL4域 GAL4家族普遍的功能是转录调节，主要调控氮源代谢、生殖繁殖等在本研究中，P-GAL4基因在此可能是调控真菌的生殖，导致犬小孢子菌在儿童的头皮组织中大量繁殖，导致头癣的发生,结

7、论,SSH1文库得到5个差异基因：1.FSH1 2.PQ-LRP 3.multidrug resistance protein MDR 4.RING zinc finger protein 5.RING zinc finger protein,putative,结 论,SSH2文库3个差异基因：1.P-GAL4 2.NADH1 3.DNA-directed RNA polymerase I subunit,结 论,FSH1和PQ-LRP基因可能在犬小孢子菌致头癣的发病机制中起重要作用P-GAL4和NADH1基因可以作为研究犬小孢子菌致头癣的候选基因,导师杨国玲教授张振颖老师大连理工大学金礼吉教授师姐张芙蓉全体皮肤科老师,致 谢,