细胞工程第五章.ppt

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1、第五章 细胞融合与单克隆抗体技术,第一节 细胞融合,一、细胞融合的发展简史二、细胞融合的基本技术三、融合细胞的筛选四、细胞融合的应用五、融合细胞的克隆化,细胞融合是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物的不同类型的细胞通过无性方式融合成一个细胞的技术。,一、细胞融合的发展简史,1838年Muller第一个描述了脊椎动物肿瘤细胞融合成多核细胞的现象。1873年，Luginbuhl 在天花脓瘪周围组织中观察到多核细胞。1907年，体外组织培养技术成功之后，人们观察到体外培养的细胞也能融合而形成多核巨细胞。1958年，日本冈田善雄(Okada)用高浓度的仙台病毒(Sendai Virus)在

2、体外成功地融合了小鼠艾氏腹水癌细胞后，细胞融合技术，得到迅速发展。,1960年，法国的Barski等首先发现不同类型的细胞在混合培养过程中自发融合的现象。1966年，Yerganian进一步用仙台病毒获得了能够增殖的杂种细胞。70年代，童第周在我国率先开展了这方面研究，将正常细胞与肿瘤细胞融合，证明正常细胞具有抗肿瘤效应。,二、细胞融合的基本技术,细胞虽在体外培养条件下会自发融合，但频率极低，故一般均须添加具有诱导细胞融合效应的生物或化学因子(融合剂)，或采用电融合技术，人为地促进细胞融合。人们把这种可以促进细胞融合，提高融合率而加入的生物试剂或化学试剂叫作细胞融合剂。,细胞融合示意图,1、细

3、胞融合的机理,细胞融合实际上包含多个过程：首先是两个亲本细胞并列，细胞膜接触，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。融合细胞表面的特征性变化，有膜成分和胞质成分交流以及细胞内电导率的连续性。,病毒融合剂(p82)：,最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类融合剂。灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。它在病毒类融合剂中最为有效，使用最广。,使用仙台病毒诱导细胞融合步骤,制备细胞悬液紫外线灭活2分钟（使仙台病毒失去致病性，仅起融合因子的作用）混合亲本细胞（高pH高Ca2+，加入灭活病毒8-10分钟）杂种细胞的筛选,化学融合剂：,常用PEG 优点

4、：融合成本低，不需特殊设备；融子合产生的异核率较高，融合过程不受物种限制 缺点：可能会对细胞造成伤害,桥梁,示意图,PEG诱导细胞融合的效果：同其分子量大小及浓度高低相关。常用分子量为10006000，浓度为3050须严格掌握PEG的处理时间。悬浮法，处理12分钟为宜。离心法，先将细胞混合物悬于3040的PEG中，再通过离心进行融合，可适当延长接触时间，以58分钟为宜。随后，均须立即加液稀释，以及时终止PEG作用。PEG溶液的pH7.48.0,电融合技术：,常用：细胞融合仪 电融合技术的原理：1）细胞膜的接触（交流电）2）细胞膜的击穿（直流电）,电融合法原理,交流电场使细胞膜表面电荷偶极化，沿

5、着电极排列，形成串珠。,施加直流电场后，形成串珠的细胞在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。,电融合技术的优点,不存在对细胞的毒害问题 融合效率高 融合技术操作简便,三、融合细胞的筛选,融合细胞的类型1)两个完态细胞的融合:同核体、异核体2）两个非完态细胞的融合：核质杂种、胞质杂种,1药物抗性突变型的筛选,药物抗性突变型：细胞突变后对某一种药物的抗性显著增加而形成的一种突变型。当把正常的野生型细胞培养在含有这一药物的培养基上，逐渐增加药物浓度，便可得到一条存活曲线（surival curve）。但是存在一些自发突变，这一细胞在药物的致死浓度中仍能生长。,0.01,0.1,1,10,100,

6、细胞活存率（log比例）,野生型,抗性突变型,增加药物浓度,A,糖+氨基酸核 苷,从头合成途径（能被氨基碟呤阻断）,“补救”途径（包含HGPRT和TK酶）,DNA,DNA合成途径,培养基中加入嘌呤类似物（N-鸟嘌呤）,细胞正常生长（HGPRT-）,细胞死亡（HGPRT+）,可通过嘌呤类似物来筛选HGPRT-细胞,正向选择,从头合成途径,HAT选择培养基含:次黄嘌呤(hypoxanthine)氨基蝶呤（aminopterin）胸腺嘧啶（thymidine）氨基蝶呤可阻止从头合成途径的过程，所以细胞内HGPRT活性必须恢复，细胞才能存活。对于这类回复突变型的选择称为反向选择(reverse sel

7、ection),补救途径,HAT培养基,细胞正常生长（HGPRT+）,细胞死亡（HGPRT-）,从头合成途径,培养基中含BrdU,细胞正常生长（TK-）,细胞死亡（TK+）,TK也可作为一种选择性标记,2营养缺陷突变型的筛选,营养缺陷突变型是培养细胞突变型中的另一种重要突变类型。这些突变型表现在合成低分子量代谢物(如氨基酸，嘌呤、嘧啶等）的能力发生了改变，以致这些细胞所产生的生物量不能满足正常生长的需要。,营养缺陷型细胞是指，在一些营养物(如氨基酸、碳水化合物、嘌呤、嘧啶或其他代谢产物)的合成能力上出现缺陷，而难以在缺乏这些营养物的培养基中存活的变异型细胞。,例：,缺乏甘氨酸和脯氨酸的培养基上

8、,甘氨酸营养缺陷型细胞脯氨酸营养缺陷型细胞融合细胞,死亡死亡存活,培养,3温度敏感突变型的筛选,较高温度生长的细胞,较低温度生长的细胞,两种温度存活,4.荧光激活细胞分选仪（FACS）筛选,不同荧光标记的脂质染料分别标记两亲本细胞，融合细胞因发两种荧光而被筛选出来。,四、细胞融合的应用,1淋巴细胞杂交瘤2基因定位3遗传基因的缺陷互补4分化功能的表达调控研究5.体细胞杂种的致癌性分析6.制作疫苗7.核移植和动物克隆,五、融合细胞的克隆化,1、克隆化的目的,1）是细胞建株的必经过程，以得到遗传特征相同的细胞；2）就杂交瘤而言，可从中筛选出稳定而同源的杂种细胞系，淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞。3）减少

9、非分泌型无关细胞生长过快。,2、饲养细胞的种类,对于培养小鼠细胞来说，主要有下列各种细胞可供作为其饲养细胞：胸腺细胞；正常的脾细胞；传代培养中的大鼠胚胎成纤维细胞；腹腔细胞，是使用得最普遍的饲养细胞。,3、克隆化培养方法：,按其分离单细胞的方法不同，大致可分为有限稀释法、软琼脂平板法、显微操作法及荧光激活细胞分类器法等数种。,1）、有限稀释法,有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到10个/ml，然后装成每小孔(96孔板)0.1ml，使每孔理论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细胞形成集落。,2）软琼脂培养法：,利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从琼

10、脂上挑出来(一般810天后)，再移到液体培养基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液的活性。,3）显微镜操作法,在倒置(或解剖)显微镜下，借助于毛细吸管将单个细胞个别吸出，分别放入已加饲养细胞的96孔培养孔内，根据原理不同，又分为普通法和玫瑰花结两种方法。,普通显微镜操作法,于6cm平皿中加入约103个细胞，CO2培养基箱中静置1小时左右无菌条件，在倒置显微镜下去平皿盖用直角转头滴管，吸出单个细胞,移至预先加有饲养细胞的96孔板内直至96孔均分装有细胞，加盖，于CO2培养箱内培养观察与更换培养方法同有限稀释法,原理：分泌抗体细胞在其表面含有抗原受体，在定的条件下常可与特异性抗原致敏的绵羊红细胞（S

11、RBC）形成玫瑰花结。,玫瑰花结,106个/mL杂交瘤细胞1致敏的SRBC 100mL,在显微镜下可见玫瑰花结形成细胞,挑玫瑰花结细胞入96孔板培养,细胞生长集落,酶联免疫吸附（ELISA）鉴定,4）盖片分离法,用钉锤于洁净的橡胶上砸干净盖片选择碎块、大小形态适用的选出加培养液及进行细胞培养倒置镜下选细胞，挑出单细胞玻片进行单个细胞培养,5）荧光激活细胞分离器法(FACS),原理是将悬液中的细胞引入一种液流的中央，使其一个接一个地通过聚焦的高能激光束，根据荧光和光放射的性质快速分析和分离细胞。荧光染料：Hoechest33258,第二节 单克隆抗体,一、单克隆抗体制备过程二、单克隆抗体的特性

12、三、单克隆抗体的应用,一、单克隆抗体的制备过程,（一）原理（二）制备过程（三）融合细胞的早期观察,（一）、原理,正常的可产生抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞在融合剂的作用下产生融合，杂交的细胞在HAT选择培养基中进行培养，得到的为杂交瘤细胞，该细胞既具有可分泌抗体的功能又可在体外大量增殖。,（二）、制备过程,1细胞培养材料的准备2亲本选择3细胞融合4杂交细胞的筛选5.杂交瘤细胞的克隆培养6.单抗的生产,1细胞培养材料的准备(p79),1）培养基：DMEM；RPMI-1640培养基2）血清：胎牛血清最好，一定选用同一批次的血清，用前要灭活并做细菌学监测。3）抗生素：防止污染,2亲本选择,一般选用与骨

13、髓瘤细胞供体细胞来源同一品系的动物进行免疫，常采用BALB/c小鼠。免疫动物的数量要多于用量。,2亲本选择,1）瘤细胞(p81)选择原则：a）：丧失自身合成免疫球蛋白的能力b）：对选择剂敏感（易从选择性培养基上除去）c）：处于对数生长期（若用冻存细胞，应在融合前一周复苏）,2亲本选择,1）瘤细胞常用：小鼠的HGPRT-骨髓瘤细胞在应用前用8-AG处理，确保HGPRT-；杀死回复突变物HGPRT+,2亲本选择,2）抗体生成细胞（B淋巴细胞）(p81),取8-12周小鼠 初次免疫（抗原注入体内，隔几天一次，2-3次）2-3周后，加强免疫（抗原量加倍），使生成的B淋巴细胞增多 3-4天后杀死小鼠（颈

14、椎脱臼法），取脾脏 剪碎，滤网过滤 淋巴细胞，红细胞（Tris-NH4Cl）收集淋巴细胞,2亲本选择,3）饲养层细胞,处死小鼠（2-3只，颈椎脱臼法）消毒浸泡，打开腹腔 注入基础培养液或PBS液 收集腹腔冲洗液 离心，去上清 HAT培养液稀释离心沉淀细胞 调细胞密度1105个/ml 0.1ml/孔加入96孔板，培养过夜，备用,常用同系的小鼠腹腔巨噬细胞,3细胞融合,PEG法,脾细胞，骨髓瘤细胞融合（10：1-2）离心，去上清，轻轻敲匀 用1ml45PEG逐滴加入 加培养液 离心，去上清 HAT培养基悬浮细胞 96孔板培养,一般3-6天可形成克隆,4杂交瘤细胞的筛选,HAT选择培养基,细胞类型

15、正常 HAT 5BudR 8Aza 培养基*培养基*培养基 培养基 正常培养细胞+-TK缺乏细胞+-+-HGPRT缺陷细胞+-+杂交瘤细胞+-（TKHGPRT）,选择培养基的作用原理,为生长，为死亡。*为PRMI1640，加入10小牛血清。*为正常培养基中，加入次黄嘌呤104M，胸腺嘧啶4107M，氨基喋呤1.616-15 M为正常培养基中分别加入20微克/毫升的5溴脱氧尿嘧啶核苷或8氮杂鸟嘌呤。,一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。常用方法有放射免疫测定法，酶联免疫吸附测定法，免疫荧光测定法，免疫组织化学监测法等。一般以方法快速、简便、特异、灵敏为

16、选择原则。可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。,5杂交瘤细胞的克隆培养,是确保杂交瘤细胞所分泌的抗体具有单克隆性和具有稳定性表达的关键一步。目的：将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染,6、单克隆抗体的生产,1）.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060gml，如果大量生产，费用较高（需大量血清增加了成本）。,6、单克隆抗体的生产,2）.体内

17、接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按13107ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml,共24点。待肿瘤达到一定大小后(一般1020天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml。但采血量有限。,6、单克隆抗体的生产,腹水的制备常规是先腹腔注射0.5ml降植烷或液体石腊于BALBc鼠，12周后腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，待腹水尽可能多，而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。缺点：因需大量活的小鼠而不适合大规模生产。同时腹水中可能含其他抗体，给抗体纯化和临床应用造成困难

18、。,二、杂交瘤技术制备单克隆抗体流程,动物免疫,分离脾细胞,制备骨髓瘤细胞,细胞融合,HAT培养基选择杂交瘤细胞,阳性孔克隆化并扩大培养,再次克隆,克隆扩大培养,扩大培养收集上清液,动物接种收集腹水,单克隆抗体纯化保存,ELISA测血清,细胞冻存,（三）、融合细胞的观察,1融合后细胞的早期观察与管理2无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析3转种与扩大培养过程中杂交瘤细胞停止生长 原因分析4不出现杂交瘤的原因分折,1融合后的细胞早期观察与管理：,及时观察、正确判断融合后的细胞生长情况是十分重要的，36天可以用肉眼或在倒置显微镜下见到杂交瘤细胞的克隆或集落，新出现的杂交瘤细胞与其周围细胞相比较，要大而明

19、亮，立体感强，每集落细胞数增殖明显。,2无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析,融合后经HAT选择有细胞克隆出现，但不能筛选出产生特异抗体的杂交瘤，常见原因是：抗体检测法不够敏感 HAT选择失败 染色体丢失和克隆竞争 动物免疫不成功,抗体检测法不够敏感,杂交瘤细胞培养上清液中，抗体含量很少，一般多在10ug/ml以下，检测方法不敏感就不能检出。,HAT选择失败,因HAT选择失败生长的细胞是骨髓瘤细胞，不是杂交瘤细胞。其原因是：1、骨髓瘤细胞系发生回复突变，由HGPRT变为HGPRT，不再对氨基喋呤(A)敏感为避免回复突变，骨髓瘤细胞应定期通过8AG传代。2、氨基喋呤对光敏感，保存不当便会失效。,染色体

20、丢失和克隆竞争,培养物中有多克隆杂交瘤时就会有“克隆竞争”，结果往往是不产生抗体的杂交瘤繁殖起来，产生抗体的杂交瘤逐渐减少消失，这是阳性杂交瘤停止产生抗体的主要原因。早期反复克隆化是防止因克隆竞争丧失分泌抗体能力的主要措施。,动物免疫不成功,为得到特异性杂交瘤，正确的免疫方法很重要。一般说，细胞颗粒性抗原（如病毒、细菌等）免疫原性好，可不用佐剂；可溶性抗原（如蛋白质、核酸等）要使用佐剂。,3转种与扩大培养过程中杂交瘤细胞停止生长原因的分析,骨髓瘤细胞系污染支原体 这种情况有时尚可融合成功，得到杂交瘤，但这种杂交瘤生活力低、转种后往往死去。,早期杂交瘤不能耐受稀释或机械刺激 在转种过程中，吹打动

21、作粗暴或把细胞稀释太多，就会发生转种后死亡。转种前杂交瘤生长状态不良转种所用的培养瓶、培养板对杂交瘤有毒，或培养液内含有毒成分也会使转种失败。,4不出现杂交瘤的原因分析：,用于杂交的免疫小鼠与骨髓细胞在亲缘关系上不一致或者有距离或由于其中一方发生变异；骨髓瘤细胞生长状况不好；小牛血清的质量有问题，PEG毒性太大或作用时间太长。,配制培养基的蒸馏水出现质量问题，或培养板或其他用具不洁净而影响细胞的正常生长。不易发观的支原体污染也是常见因素之一。,高度均一性：纯度很高的均一性抗体 高度专一性：只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应 大量产生及稳定性：杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖并传代,三、单克隆抗体的

22、特性,1、基因诊断2、基因治疗3、抗癌药物,四、单克隆抗体的应用,五、人单抗的制备,对人源化抗体的研究，历经了人鼠嵌合抗体、人源化单克隆抗体及人源性单克隆抗体三个发展阶段,1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies),人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。,人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。现在已有5种嵌合抗体进入市场，用于治疗癌症、风湿性关节炎、心肌梗塞和移植排斥。,为减少鼠源成分,人们进一步用人的替代鼠,形成更为完全的人源化抗体,即除了3个互补决定区(

23、)是鼠源的外,其余全部是人源结构,又称移植抗体或改型抗体,2 人源化单克隆抗体,经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）,3 人源性单克隆抗体,抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。优点：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，就可制备针对任何抗原的单克隆抗体,用抗体文库技术制备人源性单克隆抗体。改变了单抗制备的思路。

24、另外还兼有许多优点：如可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术;抗体基因筛选的范围广;技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产;适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。,融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。,人杂交瘤技术未获真正突破原因,六、国内有关研制抗体动向,1.军科院沈倍奋院士实验室正处于各种单抗的实验室阶段。

25、抗破伤风抗体（军科院），用于预防破伤风2医科院肿瘤研究所杨治华实验室正处于人源化单抗的实验室阶段。3医科院医生所抗FabC1027用于治疗肝癌,4 云大单克隆抗体工程技术有限公司运用中空纤维反应器技术、抗体纯化技术、免疫层析胶体金显色技术、试纸膜材纸材筛选搭配技术等成功地突破了多个技术“瓶颈”，近期将主要开发前列腺癌、乙肝、丙肝、性病、艾滋病、重大胎儿缺陷等疾病的快速诊断试纸。5 中科院遗传所抗乙型脑炎单抗用于乙型脑炎,6 北京赛科药业抗CEA嵌合抗体用于治疗结肠癌7 第四军医大学基础部第四军医大学基础部的国家一类新药碘131I肝癌单抗放免诊断剂和治疗剂，用于原发性肝癌的体内定向诊断及体内导向

26、治疗，也处于临床研究中。8 上海华晨治癌药业有限公司上海华晨治癌药业有限公司与美国南加大合作开发的碘131I人鼠嵌合型肿瘤细胞核单克隆抗体注射液（131I-chTNT），用于多种实体瘤，该药物为国家一类新药。,9 武汉生物制品研究所武汉生物制品研究所抗肾移植单抗OKT3（注射用鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体）最早批准上市，具有免疫抑制作用，可逆转对移植器官的排斥反应。该所也正在进行该单抗的人源化。10 中国科学院研制的单克隆抗体是针对肝癌的。原发性肝癌是一种非常凶险的疾病，未经治疗的病人平均生存期仅4个月左右，经过生化细胞所与集团科技人员的努力，拥有自主知识产权的国家一类抗肝癌药物，俗称生物导弹的肝癌单克隆抗体的研究取得了重大进展。,作业,1、简述用杂交瘤技术生产单克隆抗体的原理和主要过程？2、HAT选择性培养基的选择原理？,