柠檬酸发酵.ppt

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1、第四章 柠檬酸发酵机制,重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物合成的代谢调节机制。难点：柠檬酸生物合成的代谢调节机制。,一、柠檬酸简介,柠檬酸又名枸橼酸，学名-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。,第一节 概述,食品工业：酸味剂、增溶剂、抗氧化剂，除腥脱臭剂；医药工业：化学工业：美容品、化妆品,二、柠檬酸及其盐的应用概况,三、我国柠檬酸生产现状,生产状况：60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。

2、目前，生产厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生物化学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安徽华源生物药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。,第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控,1940年，Krebs:TCA；1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶；1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢；1954-1955年，Ramakrishman等发现黑

3、曲霉中存在TCA循环。,一、柠檬酸合成途径的发现,二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径,黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。,(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1,(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。,(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（P

4、EP）羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。,三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制,1、磷酸果糖激酶（PFK）：,（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节,Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响,Mn2+缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？,当培养基中Mn2+缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。,2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。,3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA,（二）三羧酸循环的调节,1、柠檬

5、酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。,2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：,顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。,顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸90:3:7。,3、-酮戊二酸脱氢酶的调节,在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个

6、显著特点是，-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。,-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应，一旦-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。-酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。,(三)氧对柠檬酸积累的调节,乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：,(1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了

7、具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。,当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。,（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸,乙醇乙酸,3醋酸 1柠檬酸生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸酵母N源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度AMP抑制NAD-异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量合成并积累。此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸=90：7：3。细胞质中积累大量异柠檬酸。,Mn2+缺乏抑制蛋白合成NH4+，有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链：解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通。丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧

8、化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。,小结：,顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。,（五）柠檬酸发酵的产率,1、无CO2固定反应的产率,合成1分子柠檬酸需要3分子乙酰辅酶A，也就是需要1.5分子的葡萄糖。,理论产率为：192/(1801.5)=71.1%,2、通过 CO2固定反应提供C4二羧酸,四、柠檬酸发酵过程的控制要点,（1）控制Mn

9、2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP畅通无阻。,（3）控制培养基中的Fe2+的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。,（2）控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。,五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：,1.透明圈大的菌株 平板：10%甘薯+2%的琼脂+0.5%CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好 2.显色圈大小 平板：麦汁培养基+pH值指示剂 诱变后，33培养3天，透明圈大的则好。,3.不分解柠檬酸的菌株 不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA循环中柠檬酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。4.选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株 在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。（为何？中间产物少，C架少，不利于合成代谢）,思考题,1.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？2.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。3.简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产率的意义。,