第十章蛋白质和氨基酸的测定.ppt
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1、第十章 蛋白质和氨基酸的测定,第一节 概述1,蛋白质是生命的物质基础:是构成细胞的组成成分:细胞膜中的蛋白质,线粒体、内质网等细胞器上的结构蛋白或酶,染色体中的核蛋白,血液中的血红蛋白,也是激素和抗体的基本成分。2,担当重要的生理功能:是生物体发育及修补组织时所需氨基酸的来源,物质代谢的生物催化剂,营养物质及气体的运输遗传信息的传递与表达人体内的组质液pH(健康pH在7.37.5之间)及水分的平衡为免疫系统制造对抗细菌和感染的抗体;一般认为成人每人每天营养需要量为:75克蛋白质。,蛋白质的组成及特性,蛋白质的组成:蛋白质由很多的AA单体以肽键结合而成的具有一定空间结构的含氮有机化合物,有的含有
2、P、S、Cu、Fe、I等元素,分子量高达数万数百万。含氮是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。蛋白质系数:一般而言,蛋白质含氮量约为16%,即1份氮相当于6.25份蛋白质,此数值(6.25)称为蛋白质系数。氨基酸的种类:自然界中已经发现的氨基酸约有170多种,其中组成蛋白的氨基酸只有22种(都是-AA),其中对人而言的必需氨基酸有8种(犬的必需氨基酸有9种)。组成蛋白的氨基酸(-AA)的通式及AA两性电解质特性:,部分食品的蛋白质含量,谷类和面食:(%)大米(糙米、长粒、生)7.9大米(白米、长粒、生)7.1小麦粉(整粒)13.7玉米粉(整粒、黄色)6.9玉米淀粉 0.3豆类:大豆(成熟的种
3、子、生)36.5豆(腰子状、所有品种)23.6豆腐(生、普通)8.1水果和蔬菜:苹果(生、带皮)0.2芦笋(生)2.3草莓(生)0.6莴苣(冰、生)1.0,肉、家禽、鱼:牛肉(颈肉、烤前腿)18.5牛肉(腌制、干牛肉)29.1鸡(可供煎炸的鸡胸肉、生)23.1火腿(切片、普通的)17.6鸡蛋(生、全蛋)12.5鱼(太平洋鳕鱼、生)17.9鱼(罐装金枪鱼滴干的固体)26.5乳制品:牛乳(全脂、液体)3.3牛乳(脱脂、干)36.2干酪 24.9酸奶(普通的、低脂)5.3,优质蛋白质(对人类而言),必需氨基酸:在组成蛋白的氨基酸中,在人体内不能合成或合成速度很慢的氨基酸。人类而言,优质蛋白质的定义:
4、l蛋白质中必需氨基酸的含量高,且总体氨基酸的组成比例接近母乳蛋白氨基酸比例的蛋白质。动物来源和豆类食品是很好的优质蛋白质。一般而言:动物性蛋白所含必需氨基酸的种类及数量较多,而植物性蛋白所含必需氨基酸的种类及数量较少。,若蛋白质或某些必需氨基酸供给不足:l 会导生物体生长发育缓慢,体重减轻,抵抗力下降,容易患病;l 男性精液品质下降,精子数量减少,性欲降低;l 女性引起不孕,即使怀孕,胎儿也常发育不良而发生死胎或畸胎。开发蛋白质的生理效价高的食品及合理配膳等 是食品科学从业者的一项重要任务!,常用的蛋白质和氨基酸的测定方法,常用的蛋白质和氨基酸的测定方法:蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法
5、,准确、操作较费时,在国内外应用普遍。双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定,由于方法简便快速,故多用于生产单位质量控制分析。另外,国外采用近红外分析仪,利用波长在0.753m范围内的近红外线具有被蛋白质组分吸收及反射的特性,建立了近红外光谱快速定量方法。在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定,通常采用酸碱滴定法来完成。本章重点:凯氏定氮法的原理及注意事项,双缩脲法、印三酮法及氨基酸自动分析仪的原理及注意事项,动物实验法,氨基酸总量的测定。,第二节 蛋白质的定性测定,考马斯亮蓝法(Stain with Coomassie blue):考马斯亮蓝法灵敏度比氨基黑高五倍,尤其适用
6、于SDS电泳的微量蛋白质的染色。在549nm有最大吸收值,蛋白质在110g呈线性关系。可以检测出0.1 ug 的蛋白质条带.但银染法可以检测出 2 ng的蛋白质条带.,Coomassie Blue STAINING PROCEDURES,1.ReagentsCoomassie Blue R-250Methanol Glacial acetic acid 2.Gel Stainning solution,1 L 1.0 g Commassie Blue R-250 450 ml water 450 ml methanol 100 ml Glacial acetic acid3.Gel desta
7、ining solution,1 L 100 ml Methanol 100 ml Glacial acetic acid 800 ml Water4.Staining Procedure1.Pick up the gel into(20 ml,usually enough)Staining solution in a container and agitate for 10 min for 0.75 mm Gel and 20 min and 1.5 mm gel.The staining solution can be reused several times.2.Take the gel
8、 out and rinse the gel with a few changes of water in a new container3.Add 50 ml destaining solution.Strong bands are visiable immediately on a light box,and 1 hour usually is enough.4.To destain completely,change destaining solution 2-3 times and agitate overnight.5.Scan or take photo to record the
9、 result.,Coomassie Blue STAINING PROCEDURES,4.银染法(Silver staining):can detect as little as 2 ng of protein in a single band in SDS-PAGE Gel.Reagents:Silver nitrate Sodilum hydroxide30%ammonium hydroxidecitric acid38%formaldehydeMethanolAcetic acidStaining procedure1.Sock gel in 50%Methanol-10%acetic
10、 acid for at least 1 hour with 2-3 chan ges of socking solution2.Rinse gel with 3 changes of water for total 30 minutes.3.silver staining for 15 mins4.Rinse gel with twice in deionized water5.Develop gel with developing solution6.stop development by ringsing in 1%acetic acid.7。wash gel in water for
11、at least 1 hour.,2DE,2-DE:the technique to separate proteins in the first dimension according to their isoelectric point,by Isoelectric Focusing(IEF),and in the second dimension according to their molecular weight,by SDS-PAGE.2-DE combined with protein identification basing on microsequencing,amino
12、acid composition and Mass spectrometry,provides an invaluable tool for proteomic studies.Step 1 Sample PrepStep 2 First-Dimension(IEF)Separation Step 3 Second-Dimension(SDS-PAGE)Separation Step 4 Protein Detection by Staining/Destaining,凯氏定氮法 凯氏定氮法是先测定总氮量,然后乘以蛋白质换算系数,即可得到粗蛋白质含量。可用于所有动、植物食品的蛋白质含量测定。但
13、因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物,故结果称为粗蛋白质含量。凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首先提出,经过长期改进,迄今已演变成常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种,至今仍被作为标准检验方法。在此主要介绍常量凯氏定氮法的原理及步骤。原理:样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出,而部分硫酸被还原成二氧化硫,样品中的有机氮转化为氨与过量的硫酸结合成硫酸铵;然后加碱蒸馏,使氨蒸出,用弱酸硼酸吸收后再以标准强酸如盐酸或硫酸溶液滴定,根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。,催化剂煮沸,1、消
14、化:NCOC+浓H2SO4(NH4)2SO4+CO2+SO2+H2O 2、氨化:2NaOH+(NH4)2SO4 2NH3+Na2SO4+2H2O 3、吸收:2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O 4、滴定:(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl 2NH4Cl+4H3BO3(注:NCOC,Nitrogen containing organic compounds),凯氏定氮法原理(方程式),凯氏定氮法注意事项,图:常量凯氏定氮消化及蒸馏装置 a消化装置 b蒸馏吸收装置,1、硫酸钾 及硫酸铜的作用2、火候控制3、装置的气密性4、何时加碱5、难消化的 对策6、停止蒸馏,说明及注意事项
15、0:当浓硫酸的用量为30ml时,硫酸铜,硫酸钾,氢氧化钠等试剂应按比例增加。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。消化时不要用强火,应保持和缓沸腾,以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物未消化完全而造成氮损失。消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶,以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。样品中若含脂肪或糖较多时,消化过程中易产生大量泡沫,为防止泡沫溢出瓶外,在开始消化时应用小火加热,并不停地摇动;或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂,并同时注意控制热源强度。当样品消化液不易澄清透明时,可将凯氏烧瓶冷却,加入30%过氧化氢23mL后再继续加热消化。若取样量较大,如干试样超过5g,可按每克
16、试样5mL的比例增加硫酸用量(何时会必要?)。一般消化至呈透明后,继续消化30min即可,但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品,如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时,需适当延长消化时间。有机物如分解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏前若加碱量不足,消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀,此时需再增加氢氧化钠用量。硼酸吸收液的温度不应超过40,否则对氨的吸收作用减弱而造成损失,此时可置于冷水浴中使用。11蒸馏完毕后,应先将冷凝管下端提离液面清洗管口,再蒸1min后关掉热源,否则可能造成吸收液倒吸。(12)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰
17、色,在酸性溶液中呈红色。,氨基酸的分析,什么是氨基酸?氨基酸的分类氨基酸的化学结构?氨基酸的两性电解质的特性,氨基酸的结构,氨氨基酸的一般显色反应 茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显色法,后一种是近年来发展起来的荧光显色法,具有灵敏度高的特点。1.茚三酮法原理:氨基酸或蛋白质能与茚三酮作用,生成蓝紫色化合物.步骤:将点有样品的层析滤纸充分除尽溶剂,用5g/L茚三酮无水丙酮溶液喷雾,充分吹干,65,30min(空气中的氨可使背景泛红色),氨基酸斑点呈紫红色。为了使各种氨基酸呈现不同颜色,可用下列方法:用0.4g茚三酮,10g酚和90g正丁醇的混合液显色。用1g/L茚三酮无水丙
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- 第十 蛋白质 氨基酸 测定
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