离心技术0911(级临床本科).ppt
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1、分析与检测技术,主讲人:宋涛生物化学与分子生物学教研室,以常用分析与检测实验技术为主线,以细胞与分子生物学、生物化学、免疫学、遗传学等学科内容为基础,使医学生初步掌握常用分析与检测实验技术的基本知识和技能、常规仪器设备的使用和保养,了解现代分子生物学技术的基本知识,熟悉各种检测指标的临床意义。,主讲内容:,一、离心原理与技术二、常用标记技术三、其它实验技术,离心原理与技术,离心技术是指利用旋转运动产生的离心力,根据物质的沉降系数或浮力密度的差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的一种技术。,洗衣机的脱水筒,“棉花”糖的制作,汽车转弯,应用:分离、纯化样品及对已纯化的样品进行结构和性质分析。,离心
2、技术是指利用旋转运动产生的离心力,根据物质的沉降系数或浮力密度的差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的一种技术。,离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。它主要用于将悬浮液中的固体颗粒与液体分开;或将乳浊液中两种密度不同,又互不相溶的液体分开(例如从牛奶中分离出奶油);它也可用于排除湿固体中的液体,例如用洗衣机甩干湿衣服;特殊的超速管式分离机还可分离不同密度的气体混合物;利用不同密度或粒度的固体颗粒在液体中沉降速度不同的特点,有的沉降离心机还可对固体颗粒按密度或粒度进行分级。,离心技术的应用 1.用于工业生产的,如化工、制药、食品等 工业大型制备用的离心技术,转速都在 每分钟500
3、0转以下。2.用于生物、医学、化学等实验室分析研究 的,转速从每分钟几千到几万转以上,此 类技术的使用目的在于分离和纯化样品,以及对纯化的样品有关性能进行研究。,内容:,第一节 离心技术的基本原理第二节 离心设备第三节 常用离心方法及应用,第一节 离心技术的基本原理,一、离心的一般原理二、离心力和相对离心力三、沉降速度四、沉降系数五、沉降时间六、测定相对分子量,一.基本原理1.离心力(Centrifugal force,F):是指悬浮颗粒在离心过程中所受的离开旋转中心轴的作用力。F=ma=m2r F:离心力(g.cm/s2或达因)m:颗粒质量 a:加速度:旋转角速度 r:旋转体离旋转轴的距离
4、n:每分钟的转数=(rad/sec),2n,60,2.相对离心力 Relative centrifugal force(RCF)RCF 就是在离心场中颗粒所受的离心力相当于它受到的地球重力的倍数,称为重力加速度。RCF=F离心力/F重力=m2r/mg=2r/g g为重力加速度(980cm/sec2),若用 2n=(rad/sec)60(2n/60)2 RCF=x r 980=1.11910-5 n2 r n:转子每分钟的转数(rpm),RCF=1.11910-5 n2 rRCF=1.11910-5(12000)23.8=6123gRCF=1.11910-5(12000)28.1=13052g,
5、Dole&Cotzias制作了转子速度和半径相对应的离心力列线图。,dx 2r2(p-m)V=.2 X dt 9 d2(p-m)=.2 X 18r:球形粒子的半径 d:球形粒子的直径:流体介质的粘度数 p:粒子的密度m:介质的密度,3.沉降速度 Sedimentation velocity(1)定义:指在强大离心作用下,单位时间内物质运动的距离。,p-m=0 即p=m V=0 S=0 粒子平衡p-m0 即pm V0 S0 粒子达到某一位置后就达到平衡p-m0 即pm1 V0 S0 粒子逆着离心方向上浮,4.沉降系数 Sedimentation coefficient(S)样品沉降率 样品颗粒的
6、大小 形状 密度 溶剂的粘度、密度 离心加速度,在一般情况下,样品的沉降特征可以用沉降系数来表示:S是指单位离心场中粒子移动的速度。沉降速度 V S=单位离心力 2 r,dx/dt,2 r,S在实际应用时常在10-13秒左右,故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位,简写S,量纲为秒。,5.沉降时间(Sedimentation Time,Ts)dx/dt S=2X 1 dx dt=2S X 1 lnX2/X1 积分得 t2-t1=S 2,X2为离心转轴中心至离心管底内壁的距离;X1为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离,样品粒子完全沉降到底管内壁的时间(t2-t1)用Ts表示则式可改
7、为 1 lnXmax-lnXmin Ts=S 2Ts以小时为单位,S以Svedberg为单位。,第二节 离心设备,一、离心机二、离心机的基本构造三、离心转头四、离心管五、离心机使用注意事项,一、离心机,离心机的基本构造,驱动电机、制冷系统、真空系统、显示系统、自动保护系统、控制系统、光学检测系统(分析型)必要配件:转头和离心管,(二).转子(Rotor)固定角式转子 水平转子 垂直转子 带状转子 连续转子 分析转头,转子的材质:铝质 较轻,耐受强度较弱,适合在较低 的转速下使用;不锈钢 耐受强度最好,但材质本身太重;钛合金 耐受强度不错,重量也比不锈钢轻。,1.水平转子(1)转子静止时,处在转
8、子中的离心管中 心线与旋转轴平行,(2)转子旋转加速时,离心管中心线由 行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋 转轴成90角,(3)粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本 一致有少量的“管壁效应”,水平转子的特点:(1)转子的重心位置较高(2)样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于 直径(3)对于多种成分样品分离特别有效(4)常用于速率区带离心和等密度离心,2.固定角式转子 离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度,角度变化在14-40之间。常见的角度 20 28 34 40,装入溶液的离心管与转轴间的角度是转子制造时形成的,永远不能改变。离心过程中离心管位置不变,样品发生重定向,离心管与转轴间的
9、夹角越小,重定向的程度越打,离心的效率就越高。,角转子的工程过程,a,b,c,d,a制备梯度,装样,把离心管插入转子中;b,离心机加速过程中,梯度和样品层发生重定向(变成径向);c,颗粒沉降形成区带;d,转子停止过程中,再次定向(变成垂直梯度),角转子由转子体、转子盖、手提把和测速环等组成,转字体中有离心管孔和底座轴孔。底座轴孔坐在转子驱动轴上,驱动轴的轴头插入其中。角转子的基本参数包括:可以容纳的离心管数目、最大装样量、最高转速、最大离心半径、最小离心半径、平均离心半径、k系数、最大相对离心加速度、离心管与转轴间的夹角、转子重量以及转子材料等。,角式转子的特点:(1)重心低,转速可较高(2)
10、样品粒子穿过溶剂层的距离略大于 离心管的直径;(3)“管壁效应”:,角式转子的特点:(3)“管壁效应”:颗粒在角转子中沉降时,沿离心力方向先撞到管壁,然后沿管壁再滑向管底。因此,在试管的一侧就会出现颗粒的沉积,此现象称为壁效应(wall effects)。壁效应容易使沉降颗粒受突然变速而产生对流干扰,尤其在分离沉降特性相似的颗粒时更为明显。,离心管孔的倾角对沉降分离效果的影响很大,角度大,颗粒沉降路径长,分离效果好。角度小,颗粒沉淀距离短,沉淀分离所需时间短,分离效率高。,在使用角转子时应注意,离心管要受到强大离心场的作用,软质离心管(如聚丙烯)在管子没有装满液体的情况下会塌陷。硬质离心管(如
11、聚碳酸脂)反复使用时会破裂。,设40000rpm时R1最小、3.8cmR2平均、5.9cmR3最大、8.1cmRCF值分别67,910g 105,400g144,700g,R1,R2,R3,在离心管的不同部位距旋转中心轴的距离也不同,那么在一定的转速下其RCF值也各不相同,3.垂直转子 离心管垂直插入转子孔内,在离心过程中始终与旋转轴平行,而离心时液层发生90角的变化,从开始的水平方向改成垂直方向,当转子降速时,垂直分布的液层又逐渐趋向水平,待旋转停止后,液面又完全恢复成水平方向。,四、离心管,材料:玻璃(低速)、塑料、不锈钢(高速、超速),五、离心机使用注意事项,1、离心要平稳2、平衡3、低
12、档启动4、合适的转头和转速5、干燥清洁6、按需选用离心管7、低温离心样品需预冷8、异常情况,停机检查9、校正,第三节 常用离心方法及应用,(一).差速离心法1、原理 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别,在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。操作过程中一般是在离心后倾倒的办法把上清液与沉淀分开,然后将上清液加高转速离心,分离出第二部分沉淀,如此往复加高转速,逐级分离出所需要的物质。,差速离心的分辨率不高,沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开,常用于其他分离手段之前的粗制品提取。,2.注意点:可用角式、水平式转头可用刹
13、车难以获得高纯度,差速离心法原理示意图,已破碎的细胞 500g,10分钟 沉淀 上清液(细胞核)10,000g,10分钟 沉淀 上清液(细胞膜碎片,线粒体,)100,000g,3小时 溶酶体 沉淀 上清液(核糖核蛋白体)(可溶性成份),例:用差速离心法分离已破碎的细胞各组份,(2)密度梯度离心法(又称区带离心法)该法又分为速率区带离心法和等密度区带离心法。样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡,在一定离心力下把颗粒分配到梯度液中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法。该法的优点是:具有很好的分辨率,分离效果好,可一次获得较纯颗粒;适用范围广,既能分离沉淀系数差的颗粒,又能分离有一定浮力
14、密度的颗粒;颗粒不会积压变形,能保持颗粒活性,并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点是:离心时间较长;需要制备梯度液;操作严格,不宜掌握。,速率区带离心法1.原理 是根据分离的粒子在离心力作用下,在梯度液中沉降速度的不同,离心后具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内形成几条分开的样品区带,达到彼此分离的目的。,速率区带离心示意图,临床常使用的分离液是聚蔗糖(Ficoll)、二氧化硅胶体Percoll及蔗糖。把静脉血中单个核细胞分离出来,前一种分离液将血液中单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)分为一个层,同时提出。而Percoll分离液将血中淋巴细胞和单核细胞分为二个梯度层,分别提取。后者
15、分离效果优于前者,但操作繁琐。,梯度液在离心过程中以及离心完毕后,取样时起着支持介质和稳定剂的作用,避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。由于pm则S0,该离心法的离心时间要严格控制,即有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带,又要控制在任一粒子达到沉淀前。此法是一种不完全的沉降,沉降受物质本身大小的影响较大,一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。,2.注意点:严格控制离心时间pm事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液不能用角式转头、只能用水平式转头不能用刹车,等密度离心法1原理 当不同颗粒存在浮力密度差时,在离心力场下,颗粒或向下沉降,或向上浮起,一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上
16、(即等密度点)形成区带,称为等密度区带离心法。等密度区带离心的有效分离取决于颗粒的浮力密度差,密度差越大,分离效果越好,与颗粒的大小和形状无关,但后两者决定着达到平衡的速率、时间和区带的宽度。,等密度区带离心示意图,特点:(1)与样品粒子的密度有关(2)与样品粒子的大小和其他参数无关(3)转速、温度不变,则延长离心时间也 不能改变这些粒子的成带位置。,2.注意点:离心时间要长可用角式转头或水平式转头粒子密度相近或相等时不宜用密度梯度溶液中要包含所有粒子密度不能用刹车,四.梯度溶液的制备(一).梯度材料的选择原则:1、与被分离的生物材料不发生反应。2、可达到要求的密度范围,且在所要求的密 度范围
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