大白鼠骨髓细胞染色体的制备方法.ppt

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1、大白鼠骨髓细胞染色体的制备,实验目的,1、初步掌握大鼠骨髓细胞染色体标本制备方法，了解操作步骤原理2、了解常用实验动物染色体的数目及特点,实验原理,1、骨髓细胞的有丝分裂指数相当高，可以从活体动物细胞骨髓中直接得到大量处于分裂中期的细胞2、秋水仙素可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型形态3、此法不需体外培养和无菌操作，易于推广,实验用品,一、材料：大白鼠二、器材：水平离心机、显微镜、刻度离心管（15ml）、纱布、注射器、预冷的载玻片、培养皿、镊子、剪刀、解剖刀、解剖盘、吸管、酒精灯三、试剂 1、0.1%秋水仙素（5ml）：5mg秋水仙素+5ml生理盐水，4避光保存

2、2、生理盐水（500ml）：4.5gNacl+500ml水,3、Giemsa原液（pH6.8）：1g Giemsa染粉+33mL 甘油+45mL 甲醇4、2%柠檬酸钠溶液：2g+100ml水5、0.4%KCL：0.4g+100ml水6、Carnoy固定液（100ml）：3份95%酒精和1份冰醋酸7、0.067mol/L磷酸缓冲液（pH6.8，500ml）：11.94g Na2HPO4.12H2O+4.536g KH2PO4+500ml水8、1:10 Giemsa磷酸缓冲液染液（pH6.8）,实验方法,1、秋水仙素处理：实验前3-4h，按动物每克（160g）体重4g/g的剂量，腹腔注射秋水仙素2

3、、取股骨：颈椎脱臼法处死大白鼠，剪开后腿上的皮毛，取出股骨和胫骨，剔除上面的肌肉，洗净3、收集骨髓细胞：剪去两端，将1ml 2%的柠檬酸钠溶液注入骨髓腔，将骨髓细胞先冲入小碟内，反复吸打骨髓细胞，使细胞团块分散，转入15ml离心管4、低渗处理：视骨髓量的多少加入0.4%KCL溶液810ml，然后将离心管置37水浴中低渗10min5、固定：以1000r/min离心8min，弃上清液，沿离心管壁缓缓加入新配的固定液，注意不要冲动细胞团块。加完后用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20min，反复23次，每次20min,6、制细胞悬液：固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多少加少量新配制的

4、固定液，将细胞团块轻轻吸打成悬液7、滴片：在事先在冰水中预冷的载玻片，从高处向载玻片上滴12滴上层细胞悬液（使细胞分散良好，以便观察），酒精灯上文火烘干8、染色：将玻片平放，细胞面朝上，每片滴加1:10 Giemsa磷酸缓冲液染液34mL，染色10min9、在自来水下细流冲洗数秒，去掉Giemsa磷酸缓冲液染液，擦干玻片底面和四周，镜检（染色体为紫红色）。,实验结果,注意事项,1、低渗处理是实验成败的关键。目的是使细胞体积胀大，染色体松散，时间过长会造成细胞破裂，染色体丢失；时间过短，细胞内染色体则易聚集一起，难以计数2、滴片前保留的固定液不宜过多，否则细胞悬液过稀，滴到片子上的细胞和染色体太少，不易在镜下找到3、滴片时使用的载玻片不要过早从冷蒸馏水中取出，以免载玻片升温。滴片时载玻片上的水不必擦去，直接将细胞悬液滴在湿载玻片上即可4、收集细胞步骤，减去股骨两端时，不要剪掉太多，以防骨髓细胞丢失太多5、在滴片步骤，让细胞从高处坠落，可使细胞分散良好，以便于后期观察,作业,1、记录所观察大白鼠骨髓细胞染色体的数目和形态。2、绘制染色体图,思考题,1、你制备的大白鼠染色标本，分裂相是否多，染色体分散程度如何？有什么不足处，原因何在？2、如果在实验前不给大白鼠腹腔注射秋水仙素，所制备的染色体片会出现怎样的情况？,