第三章 细胞工程实验室配置及基本技术.ppt

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1、第三章 细胞工程实验室配置及基本技术,1 实验设置2 基本技术要求无菌环境与无菌操作3 培养条件4 离体培养的营养需求,1 实验室设置,细胞工程实验室必须满足三个基本的需要：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。,1.实验室设置 一.实验室组成,1基本实验室 准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁

2、。,1.实验室设置 一.实验室组成,2辅助实验室 细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。,1.实验室设置 一.实验室组成,Culture room,Preparation room,sterilizing,Sterile operation,Cytology room,Transition area,实验室布局示意图,

3、2.实验室设置 二.基本设备配置,基本设备 冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾 消毒器、紫外灯。无菌操作设备 净化工作台、接种箱。光温控制设备 时间程序控制器、空调及温度感应器。细胞培养设备 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。,2.实验室设置 二.基本设备配置,灭菌设备,2.实验室设置 二.基本设备配置,无菌操作设备,2.实验室设置 二.基本设备配置,光照培养及控制设备,2.实验室设置 二.基本设备配置,2.实验室设置 二.基本设备配

4、置,2.基本技术 一.洗涤技术,洗涤液：弱 用重铬酸钾50g加入蒸馏水1L，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸90ml。中 用重铬酸钾50g加入蒸馏水100ml，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸875ml。强 与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸1L加入重铬酸钾50g。,2.基本技术 一.洗涤技术,洗涤方法 玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿 已使用过的试管、烧杯、三角瓶 吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品 塑料用品洗涤 一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较 强，因此冲洗时必须反复多次，最后用 蒸馏水冲洗。金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一

5、般用酒精擦洗，然后火 焰干燥。,2.基本技术 二.灭菌、消毒,物理方法：物理灭菌 干热、湿热、射线处理、过滤、离心沉淀等 化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌 外植体灭菌技术：对外植体伤害小，灭菌效 果好,2.基本技术 二.灭菌、消毒,培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌.玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热 至15040分钟，或1202小时.金属器皿：干热灭菌.接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲 醛加高锰酸钾，一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾.外植体：一般使用化学灭菌剂 灭菌.,几种常用消毒剂的效果比较,3.培养条件 一.光照的影响,光照时间 光照强度 光质,3.培养条件 二.温度

6、的影响,在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细胞分裂速率，而适当提高温度则有利于细胞伸长，在一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。,温度对菊芋愈伤组织细胞生长的影响,3.培养条件 二.温度的影响,3.培养条件 三.湿度的影响,组织培养中湿度的影响有两个方面：一是培养容器内的湿度条件，一是环境的湿度条件。容器内的相对湿度几乎是100%；二是环境的相对湿度一般要求7080%。,3.培养条件 四.pH值,通常使用的pH值范围是5.06.5。pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。,3.培养条件 五.渗透压,事实上为了某些培养需要，在设计培养基时

7、就应该考虑渗透压的问题，如White培养基的渗透压为0.15个大气压，MS培养基为1.9个大气压。此外，培养基的渗透压除用蔗糖调节外，常用的还有甘露醇，山梨醇等。,3.培养条件 六.气体影响,CO2、O2,3.培养条件 六.气体影响,4.离体培养的营养需求,一.无机盐类二.有机化合物三.植物激素四.其它附加成分,4.离体培养的营养需求 一.无机盐类,植物生长发育的基本元素:N,P,K,Ca,Mg,S,Fe,Mn,B,Cu,Zn,Mo,Cl,C,H,O。必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面：一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶

8、的活化剂，参与植物的代谢活动；三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用；四是在发育过程中，影响组织器官的建成。,4.离体培养的营养需求 一.无机盐类,大量元素 培养基的大量元素使用量一般在每升几十至 几千毫克。大量元素包括C,H,O,N,P,K,Ca,Mg,S微量元素 微量元素的用量一般低于10-510-7克分子浓 度。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co,4.离体培养的营养需求 二.有机化合物,有机化合物 糖；维生素；肌醇；氨基酸及其它如水解酪蛋白、水解乳蛋白等,4.离体培养的营养需求 三.植物激素,生长素：IAA、NAA、

9、2,4-D、IBA等。细胞分裂素：KT、BA、玉米素等。其它：GA3、ABA、B9等。,4.离体培养的营养需求 四.其它附加成分,琼脂 活性炭等,4.离体培养的营养需求 MS 培养基配方（mgl-1),KNO3 1900 ZnSO47H2O 8.6NH4NO3 1650 NaMoO42H2O 0.25MgSO47H2O 370 CuSO45H2O 0.025 CaCl22H2O 440 KI 0.83KH2PO4 170 CoCl26H2O 0.025 FeSO47H2O 27.8 Nicotinic acid 0.5Na2-EDTA 2H2O 37.3 Glycine 2.0MnSO44H2O 22.3 VB6 0.5 H3BO3 6.2 VB1 0.1,培养基的配制方法在实验课具体讲述,