基因结构与功能分析.ppt
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1、生物化学与分子生物学,第二十二章 基因结构与功能分析技术,The Analysis Technology for Gene Structure and Function,人类的多种疾病都与基因的结构或功能异常有关,因此,要阐明疾病发生的分子机制和进行有效的诊断与防治,均需首先揭示基因的结构与功能。DNA序列测定基因转录起点及其启动子的分析基因编码序列的分析基因拷贝数及其表达产物的分析基因功能获得和/或缺失策略随机突变筛选策略,第一节 基因结构分析技术,一、基因一级结构解析技术,基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序,解析一级结构最精确的技术就是DNA测序(DNA sequencing)。,(一
2、)双脱氧法和化学降解法是两种常规的DNA测序方法,Sanger双脱氧测序(dideoxy sequencing)法,Maxam-Gilbert化学降解测序法,(二)全自动激光荧光DNA测序技术的原理基于Sanger双脱氧法,1.四色荧光法:采用四种不同的荧光染料标记同一引物或4种不同的终止底物ddNTP,最终结果均相当于赋予DNA片段4种不同的颜色。因此,一个样品的4个反应产物可在同一个泳道内电泳。2.单色荧光法:采用单一荧光染料标记引物5-端或dNTP,所有产物的5-末端均带上了同一种荧光标记,一个样品的四个反应必须分别进行,相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳,(三)焦磷酸测序是一种基于发
3、光法测定焦磷酸的测序技术,焦磷酸测序技术操作简单,结果准确可靠,可应用于单核苷酸多态性位点(SNP)分析、等位基因频率测定、细菌和病毒等微生物的分型鉴定、CpG甲基化分析、扫描与疾病相关基因序列中的突变点等领域。该方法的测序长度一般短于Sanger法。,(四)循环芯片测序被称为第二代测序技术,循环芯片测序(cyclic-array sequencing),可实现大规模并行化分析 不需电泳,设备易于微型化 样本和试剂的消耗量降低,降低了测序成本,优势:,技术平台:454测序、Solexa测序(Illumina测序)、SOLiD测序等。,基本流程:,将基因组DNA随机切割成为小片段DNA;在所获小
4、片段DNA分子的末端连上接头,然后变性得到单链模板文库;将带接头的单链小片段DNA文库固定于固体表面;对固定片段进行克隆扩增,从而制成polony芯片。针对芯片上的DNA,利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应,通过读取碱基连接到DNA链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。,(五)单分子测序技术被称为第三代测序技术,主要策略:,通过掺入并检测荧光标记的核苷酸,来实现单分子测序,如单分子实时技术(single molecule real time technology,SMRT);利用DNA聚合酶在DNA合成时的天然化学方式来实现单分子测序;直接读取单分子DNA序列信息。,二、基因转录起点分
5、析技术,转录起点(transcription start site,TSS),(一)用cDNA克隆直接测序法鉴定TSS,以mRNA为模板,经逆转录合成cDNA第一链,同时利用逆转录酶的末端转移酶活性,在cDNA第一链的末端加上polyC尾,并以此引导合成cDNA第二链。将双链cDNA克隆于适宜载体,通过对克隆cDNA的5-末端进行测序分析即可确定基因的TSS序列。,该方法比较简单,尤其适于对特定基因TSS的分析。但可导致5-末端部分缺失,从而影响对TSS的序列测定。,(二)用5-cDNA末端快速扩增技术鉴定TSS,常用的技术包括5-末端基因表达系列分析(5-end serial analysi
6、s of gene expression,5-SAGE)和帽分析基因表达(cap analysis gene expression,CAGE)技术。,(三)用数据库搜索TSS,利用对寡核苷酸帽法构建的全长cDNA文库5-末端测序所得的数据信息建立了一个TSS数据库(database of transcription start sites,DBTSS),并在此基础上,通过将寡核苷酸帽法和大量平行测序技术相结合开发了一种TSS测序法,从而实现了一次测试可产生1107 个TSS的数据。,三、基因启动子结构分析技术,(一)用PCR结合测序技术分析启动子结构,该方法最为简单和直接,即根据基因的启动子序
7、列,设计一对引物,然后以PCR法扩增启动子,经测序分析启动子序列结构。,(二)用核酸-蛋白质相互作用技术分析启动子结构,1.用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点,足迹法(footprinting)是利用DNA电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域,它是研究核酸-蛋白质相互作用的方法,而不是专门用于研究启动子结构的方法。,分类:,酶足迹法化学足迹法,(1)用核酸酶进行足迹分析,酶足迹法(enzymatic footprinting)是利用DNA酶处理DNA-蛋白质复合物,然后通过电泳分析蛋白质结合序列。常用的酶有DNA酶I(DNase I)和核酸外切酶III。,(2)用化
8、学试剂进行足迹分析,化学足迹法(chemical footprinting)是利用能切断DNA骨架的化学试剂处理DNA-蛋白质复合物,由于化学试剂无法接近结合了蛋白质的DNA区域,因此在电泳上形成空白区域的位置就是DNA结合蛋白的结合位点。最常用的化学足迹法是羟自由基足迹法(hydroxyl radical footprinting)。,2.用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子,电泳迁移率变动分析(EMSA)和染色质免疫沉淀(ChIP)只能确定DNA序列中含有核蛋白结合位点,故尚需结合DNA足迹实验和DNA测序等技术来确定具体结合序列。,(三)用生物信息学预测启动子,1.用启动子
9、数据库和启动子预测算法定义启动子,在定义启动子或预测分析启动子结构时应包括启动子区域的3个部分 核心启动子(core promoter);近端启动子(proximal promoter):含有几个调控元件的区域,其范围一般涉及TSS上游几百个碱基;远端启动子(distal promoter):范围涉及TSS上游几千个碱基,含有增强子和沉默子等元件。,2.预测启动子的其他结构特征,启动子区域的其他结构特征包括GC含量、CpG比率、转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。,用于启动子预测的数据库:EPD(eukaryotic promoter databases)数据库,主要预测真核RNA聚
10、合酶型启动子,数据库中的所有启动子数据信息都经过实验证实;TRRD(transcription regulatory region databases)是一个转录调控区数据库,数据来源于已发表的科学论文。,四、基因编码序列分析技术,(一)用cDNA文库法分析基因编码序列,cDNA克隆测序或构建cDNA文库是最早分析基因编码序列的方法。全长cDNA文库可以通过mRNA的结构特征进行判断,mRNA的序列基本都由3部分组成,即5-UTR、编码序列和3-UTR。cDNA末端快速扩增(RACE)技术是高效钓取未知基因编码序列的一种方法。核酸杂交法可从cDNA文库中获得特定基因编码序列的cDNA克隆。,(
11、二)用RNA剪接分析法确定基因编码序列,高通量分析RNA剪接的方法:,基于DNA芯片的分析法 交联免疫沉淀法 体外报告基因测定法,选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序列标签(expression sequence tag,EST)的比较进行鉴定,但这种方法需进行大量的EST序列测定;同时由于大多数EST文库来源于非常有限的组织,故组织特异性剪接变异体也很可能丢失。,(三)用数据库分析基因编码序列,在基因数据库中,对各种方法所获得的cDNA片段的序列进行同源性比对,通过染色体定位分析、内含子外显子分析、ORF分析及表达谱分析等,可以初步明确基因的编码序列,并可对其编码产物的基本性质进行分析。利
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- 关 键 词:
- 基因 结构 功能分析
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