基因工程育种微生物遗传育种.ppt

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1、1,第五章 基因工程育种Genetic engineering,基因工程是将不同生物的基因在体外人工剪切组合，并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。,2,奠定基因工程的三项关键技术DNA的特异切割 Smith 和Nathans 获1978年诺贝尔医学奖DNA的分子克隆 Berg（1972）将猴病毒SV40 DNA与噬菌体基因融合，成功构建重组DNA；Cohen 和Boyer（1973）将质粒pSC101与R的tetrkmr基因融合，并将重组DNA转化E.coli，首次实现了DNA的分子克隆。DNA的快速测序

2、Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化学法DNA快速测序技术 1980年诺贝尔化学奖：Berg,Gilbert,Sanger,3,分离或合成基因；通过体外重组将基因插入载体；将重组DNA导入细胞；扩增克隆的基因；筛选重组体克隆；对克隆的基因进行鉴定或测序；控制外源基因的表达；得到基因产物或转基因动物、转基因植物,基因工程操作的主要步骤,4,第一节 基因克隆的酶学基础,一、限制性核酸内切酶restrictive endonuclease核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。核糖核酸酶(RNase)与脱氧核糖核酸酶

3、(DNase)核酸外切酶：exonuclease核酸内切酶：endonuclease,5,1、寄主控制的限制与修饰作用（1）寄主控制的限制作用(Restriction)作用：破坏外源DNA，使之迅速降解机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列并进 行切割（2）寄主控制的修饰作用(Modification)作用：保护自身的DNA，使之不受限制机制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到 限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。,6,2、限制性核酸内切酶的类型,7,3、限制性核酸内切酶的命名用产生菌的属名一个字母(大写，斜体)种名两个字母(小写，斜体)菌株名一个字母编号（罗马数字）例EcoRI

4、,EcoRII：从E.coli Rye13菌株中获得HindI，HindII，HindIII：从Haemophilus influenzae d菌株获得,8,4、型限制性核酸内切酶的基本特征（1）识别序列：一般48bp，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构(palindromic structure)例：AluI：5-AGCT-3 AsuI：5-GGNCC-3 PstI：5-CTGCAG-3,9,（2）切割：产生平末端：SmaI,5-CCCGGG-33-GGGCCC-5,产生3-OH单链粘性末端:PstI,5-C TGCA G-33-G ACGT C-5,产生5-P单链粘性末端:EcoRI,5-

5、GAATT C-33-C TTAA G-5,10,11,酶剪切条件,需要镁离子的存在，特定的酸碱度和离子强度。辅助条件：DTT、牛血清蛋白。抑制因子：杂蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐浓度。其它：甘油浓度等可以改变对序列的识别。,12,狭义：来源不同但识别和切割相同序列的酶。Hpa与MspI:CCGG广义：来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同异功酶（neoschizomer）：SmaI和XmaI，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末端，后者切后产生粘性末端。,（3）同裂酶(isoschizomers),13,两种酶切割序列不完全相同，

6、但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶 BamHI:GGATCC Bgl：T GATCA,（4）同尾酶(isoocaudamer),14,二、DNA连接酶（DNA ligase）催化两个双链DNA片段相邻的5-P与3-OH之间形成磷酸二酯键。1、体外DNA连接连接具有互补粘性末端的DNA片段连接具有平末端的DNA片段先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，再行连接,15,2、连接用酶（1）T4 DNA连接酶：催化反应需要Mg+2,ATP催化粘性末端连接，效率较高催化平末端连接（2）大肠杆菌连接酶催化反应需要NAD+只能催化粘性末端的连接,16,减少载体自身连接的方法：脱磷酸；双

7、酶切,17,三、反转录酶(reverse transcriptase)催化以mRNA为模板的cDNA的合成 cDNA（complementary DNA）：互补于mRNA的DNA片段,18,Reverse transcription,19,四、末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase)催化将脱氧核苷酸连接至DNA分子末端的3-OH上向3-单链末端上连接：Mg+2向平末端上连接：Co+2五、Taq DNA聚合酶来源：栖热水生菌 Thermus aquaticus,20,第二节 基因的克隆载体(cloning vector),克隆载体：以繁殖DNA片段

8、为目的的载体克隆载体的基本要求在细胞中能进行自主复制，为松弛型;具有多种限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入，并且插入后不影响载体的复制;容易进入宿主细胞，进入效率越高越好，并且容易从宿主细胞中分离纯化出来，以便于重组操作;具有可供选择的遗传标记,21,一、质粒载体1、质粒的一般生物学特性(1)环状双链质粒DNA的构型共价闭合环状DNA(cccDNA):两条链均保持完整的环状构型，通常呈现超螺旋的SC构型开环DNA(ocDNA)：一条链保持完整的环状结构，另一条链出现有一至数个缺口，即OC构型线形DNA(l DNA)：质粒DNA经过适当的限制性核酸内切酶的切割后，发生双链断裂，称L构型,

9、22,23,(2)表型效应性别：F，SCP1抗生素类物质合成：SCP1，Col抗药性：R分解性质粒：CAM(樟脑)，TOL(甲苯)酶的合成：Rye13隐蔽性质粒(cryptic plasmid)：2m,24,(3)质粒的分类分子量：大型质粒：MW40106d 小型质粒：MW10106d复制类型 严紧型质粒(stringent)：13 copies/cell 松弛型质粒(relaxed)：1060,or more,25,接合类型 接合型质粒(conjugative)非接合型质粒(nonconjugative)质粒的不亲和性(incompatibility)在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切

10、的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。同一不亲和群：不能共存于同一细胞中不同的不亲和群：能共存于同一细胞中,26,(4)质粒的命名质粒名以三个英文字母加阿拉伯数字表示,27,为了说明质粒的来源、性状，有时需要标出缺失、插入等pXY9109：FDtraA3(63.1-64.0kb)pXY2101：pXY101W40kb:k12hisA:1.5kb(5)与质粒有关的菌株的命名E.coli k12:E.coli C600：k12(F-)(l-)thr leu tonA lacY thiE.coli XY100：C600(F155)(pXY1234),28,2、质粒克隆载体（1）特性具有

11、独立复制起点;具有较小的相对分子量（1200kb）,克隆外源DNA片段一般不超过15kb；具有较高的拷贝数（10200）；具有便于选择的标记；易于导入细胞；具有安全性,29,（2）克隆质粒载体,30,31,质粒分离的步骤：,粗提,精提,32,氯化铯梯度离心法：有效地去除蛋白质、RNA、染色体DNA、受损质粒。,33,二、l噬菌体克隆载体1、优点遗传学背景十分清楚载体容量大，23kb具有较高的感染效率2、类型插入型载体:较小片段DNA的插入（10kb以内）；取代型载体：较大片段DNA的插入；重组DNA分子大小为l噬菌体DNA的75105；野生型DNA为 48kb，噬菌体的包装上限是 51kb。编

12、码必要基因的DNA区段占28kb，因此载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。,34,插入型载体,35,取代型载体,36,3、l噬菌体克隆载体的导入转染：用重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。效率低：未经任何基因操作处理的新鲜制备的DNA，其典型的转染效率也仅为 105106噬菌斑/微克DNA，体外连接的结果，转染效率便下降到了104103左右。DNA的体外包装：在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒，形成有感染功能的病毒载体。,37,三、柯斯质粒载体(cosmid vector)由l噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或

13、多个限制酶单一位点，来自l噬菌体粘性末端的DNA片段（cos位点）。,38,优点具有l噬菌体的特性，在体外包装后具有噬菌体的高效感染力；具有质粒DNA的复制方式；具有克隆大片段外源DNA的能力(45kb)；具有与同源序列的质粒进行重组的能力,39,柯斯克隆（cosmid cloning）应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术,40,第三节 基因工程的基本操作,一、目的基因的获得1、从供体细胞的DNA中分离（基因文库的构建）基因文库：某生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。如“鸟枪法”(Shotgun Method),41,步骤提取染色体DNA限制酶解电泳分离与载体

14、连接导入宿主筛选阳性克隆,42,2、从mRNA合成cDNA(cDNA文库构建）所谓cDNA文库是指某生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。,43,步骤提取mRNA反转录合成cDNA第一链合成cDNA第二链与载体连接导入宿主细胞筛选阳性克隆,44,3、PCR体外扩增目的基因PCR（Polymerase Chain Reaction）聚合酶链式反应：利用特殊的DNA聚合酶，在体外扩增位于两段已知序列之间的特定DNA区段的方法。(1)PCR组成：含目标DNA序列的模板DNA寡核苷酸引物DNA聚合酶：Taq 或 PfudNTPs缓冲体系和金属离子,45,(2)PCR过程变性(denaturation)

15、：90以上退火(annealing)：4060 延伸(extension)：72 如此进行2040 个循环，DNA量扩增106107倍。,46,47,48,4、基因的化学合成主要应用于已知核苷酸序列的、分子量较小的基因的制备。通常先合成一定长度的具有特定序列的寡核苷酸片段，然后再组装成完整的基因。方法主要有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法和自动化法等。,49,二、目的DNA与载体的连接1、粘性末端连接2、平齐末端连接3、同聚末端连接4、人工接头连接,50,三、重组DNA导入宿主细胞,1、转化或转染2、体外包装与感染3、电穿孔法electroporation常用宿主系统,51,

16、过程：连接反应的混合液+感受态细胞;冰浴10至30分钟;热休克0.5至2分钟;加入培养基37C振荡培养1小时;涂布平板，培养。,52,四、重组体的筛选与鉴定1、遗传学方法：检测选择性标记2、核酸杂交方法：检测目的基因3、免疫化学方法：检测目的基因产物4、直接检出法：检测目的基因产物,53,五、DNA序列测定Sanger双脱氧链终止法1、试剂引物模板：待测序DNADNA聚合酶dNTPsddNTP,54,2、测序反应3、制备聚丙烯酰胺凝胶3、凝胶加样4、电泳5、结果记录与分析,55,56,57,六、外源基因的表达影响表达的因素细胞中基因拷贝数：拷贝数多，产物多转录水平：启动子与RNA多聚酶的统一翻

17、译水平：mRNA的核糖体结合部位与宿主核糖体的统一；密码子与tRNA的统一；mRNA的稳定性外源基因的插入方向转录后的修饰及翻译后的修饰,58,第四节 基因工程的实际应用,微生物发酵病毒疫苗哺乳动物蛋白（人源蛋白药物）转基因动植物环境生物技术基因诊断与基因治疗蛋白质工程（定点突变、定向进化）代谢工程,59,复习题1、何谓基因工程？基因工程操作主要步骤。2、何谓限制性核酸内切酶？型限制性核 酸内切酶有何特点？3、克隆载体的基本要求。4、质粒的表型效应、分类、命名。5、目的基因的获得途径6、名词：基因文库、cDNA文库、PCR、质粒不亲和性,60,插入钝化/失活（insertional inact

18、ivation)由于外源DNA插入到某一基因内而使其功能丧失的现象。受体细胞是Amp、Tet的敏感型在Amp+Tet培养基上生长的是野生型质粒只在Amp培养基上生长的带有重组质粒,选择性标记筛选,61,b-半乳糖苷酶显色反应（蓝白斑筛选）-半乳糖苷酶能将无色底物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的5-bromo-4-chloroindigo，菌落呈蓝色宿主基因合成的是缺失N-末端1141氨基酸的缺陷型酶，无活性pUC系列等质粒具有lacZ基因，所编码酶的N-末端片段与宿主基因产物组成有活性的酶（-互补），菌落呈蓝色pUC质粒上在lacZ中间具有MCS，外源DNA片段的插入，使lacZ无完整产物，不

19、能与宿主产物组成有活性的酶，菌落呈无色,62,转化子电泳分析,63,64,常用宿主系统,受体细胞应具备的条件限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-；重组整合缺陷型RecA-（对于用于基因扩增或基因高效表达的受体）；具有较高的转化效率 具有与重组体互补的遗传性状 无毒，无致病性，感染与寄生缺陷型（安全角度的要求）生长迅速，容易培养遗传背景清楚，遗传性状稳定,65,各种生物受体细胞的特性大肠杆菌：繁殖迅速，载体系统完备，遗传背景清楚；产内毒素，潜在致病性，蛋白质分泌难枯草杆菌：无潜在致病性，不产内毒素，蛋白质分泌；遗传不稳定性，高蛋白酶活性链霉菌：原核生物基因的克隆表达及蛋白产物的分泌酿酒酵母：繁殖迅速，遗传背景清楚，真核性；蛋白质产物含量太高，基因表达产物难于分离纯化，适用于真核生物基因的表达,66,各种生物受体细胞的特性毕赤酵母：繁殖迅速，可以高密度培养，甲醇营养型，真核性，本身蛋白质产物分泌少；翻译后过度修饰（？）高等动物细胞：分子重组表达系统健全，真核性；细胞培养要求苛刻，生长缓慢。适用于人源基因产物的表达高等植物细胞：农作物的经济意义重大，转基因细胞易于分化，细胞培养简单；遗传操作困难繁琐。适用于植物基因的表达及植物品种的改良,