原核生物的基因调控.ppt

《原核生物的基因调控.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《原核生物的基因调控.ppt（185页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第14章 原核生物基因的表达及其调控,概 述,Thus the differential transcription of different genes largely determines the actions and properties of cells.,生命的一个基本现象,哪些基因被转录，转录的效率如何。,mRNA类型，mRNA数量。,蛋白质的类型，蛋白质的数量。,特定细胞的功能和属性。,第一节 原核生物基因的转录和翻译,原核生物的DNA：单个裸露的DNA 不编码占5%转录和翻译同一时间、地点进行 转录水平调控为主，兼有翻译水平调控,根据基因表达产物可划分：组成型蛋白：基因表达不

2、受时期、部位、环境 影响组成型表达。调节型蛋白/适应型蛋白：基因表达受时期、部位、环境影响非组成型表达。一种生物的整套遗传密码可以比作一本密码字典,该种生物的每个细胞中都有这本字典。为什么基因只有在它应该发挥作用的细胞内和应该发挥作用的时间才能呈现活化状态?结论：必然有一个基因调控系统在发挥作用。,基因调控主要在三个水平上进行:.DNA水平.转录水平.翻译水平,一、转录的起始 转录是原核生物基因表达的主要调控点，主要涉及两个方面：1、RNA合成的酶系；2、RNA合成起始和终止信号，即DNA分子上的特定序列。通过RNA聚合酶、转录因子和启动子的相互作用实现转录调控，改变细胞的表型，从而实现细胞生

3、理状态和环境的变化。,（一）RNA聚合酶(RNA polymerase)：大肠杆的的RNA聚合酶：由5个亚基组成，即2，有时还有2个 亚基。以2组成的酶称全酶。亚基与其他亚基结合较松弛，易从全酶上解离；其余部分2称为核心酶(core enzyme)。,在大肠杆菌中还发现一种新的因子，称为因子，因此将含有亚基的全酶称为全酶I，含有亚基的称为全酶。二者的不同在于：全酶可以利用双链DNA为模板合成po1yA)。亚基作用：参与启动子的识别和结合以及转录起始复合物的异构化。细胞内哪条DNA链被转录、转录方向与转录起点的选择都与亚基有关。,离体实验表明：全酶所转录的RNA和细胞内所转录出的RNA，其起始点

4、相同，序列相同，若仅用核心酶进行转录，则模扳链和起始点的选择都有很大的随意性，而且往往同一段DNA的两条链都被转录。由此可见：亚基对识别DNA链上的转录信号是不可缺少的，它是核心酶和启动子之间的桥梁。因子的取代在细胞发育和对环境应答的反应中起主导作用。如在枯草杆菌中就有不同相对分子质量的因子(P227表91),核心酶的亚基作用：对RNA聚合酶的功能至关重要，参与RNA合成、终止信号的识别。由于亚基与RNA的前体核昔三磷酸具有很高亲和力，推测它可能参与底物的结合，以及催化磷酸二酯键的形成。亚基作用：可使聚合酶结合到模板DNA上。亚基作用：游离状态，常以二聚体的形式存在，参与全酶同启动子的牢固结合

5、。,RNA聚合酶体积很大，横跨近60个碱基，而解旋的DNA区域可能不到17个碱基。当聚合酶按53方向延伸RNA链时，解旋的DNA区域也随之移动。靠近3端的DNA不断解旋。同时在5端重新形成DNA双链，不断将RNA-DNA杂合链中的RNA链挤出。,（二）启动子(promoter)：转录的起始是基因表达的关键阶段，启动子就是连接在基因3端上游的DNA序列，其长度从100 bp到200 bp不等，是转录起始时RNA聚合酶识别、结合的特定部位，但其本身并不被转录。,在启动子与终止子之间是一个转录单位，通常将mRNA开始的一个核苷酸定为o点(即+1)。由此向右常称为下游(downstream)，其核苷酸

6、依次编为正序号；起始点左例称为上游(upstream)，其核苷酸则依次以负号表示，紧接起始点左侧的核苷酸为-1。,原核生物启动子结构含有同源序列。整个启动子包括两个部分：其上游部分是CAP-cAMP结合位点，下游部分是RNA聚合酶的进入位点。（P228-229）,Catabolite gene activation protein,CAP,代谢分解物基因激活蛋白,二、转录的终止（一）终止子及其结构：1、概念：DNA上提供转录停止信号的一段序列称为终止子(terminator)，是一个基因的末端或是一个操纵子的末端的一段特定序列。2、类型：强终止子和弱终止子强终止子：不依赖于Rho蛋白质辅助因子

7、而能实现终止作用，这类终止子属于强终止子；弱终止子：依赖于Rho蛋白糖助因子才能实现终止作用，这类终止子属于弱终止子。蛋白质辅助因子称为释放因子，通常称为因子。,所有原核生物的终止子共同的序列特征：即在转录终止点之前有一段回文结构，因而所产生的mRNA可形成茎环状的发夹结构，它可使RNA聚合酶的移动停止或减缓。回文结构中富含GC对，在回文序列的下游常有68个AU对，因此这段终止子转录后形成的RNA具有与A相对应的寡聚U，是使RNA聚合酶脱离模板的信号。,依赖子因子的终止子 其回文序列中GC对含量较少，回文序列下方没有固定结构，其AU对含量也较低，因而是弱终止子，必需有因子存在时才发生终止作用；

8、这也就是说依赖于因子的终止子由于其茎环结构常较短，在没有因子时这种茎环结构不稳定。即如果没有因子存在RNA聚合酶会继续转录下去，这就称为通读(read through)，当因子存在时，转录才能终止。,在强终止子中，由于其DNA模板上富含GC而使转录出的RNA上富含C和G，于是RNA与模板之间可以形成较强的氢键，成为DNARNA杂合分子，从而阻碍DNA聚合酶的前进而有利于终止。（二）因子辅助终止作用的机理,(三)基因表达的极性现象 在正常情况下原核基因表达时，其转录出来的mRNA随即进行翻译，这时整个mRNA都覆盖着核糖体，因子无法接近mRNA而RNA聚合酶早已越过前面的基因的依赖因子的终止子，

9、所以转录实际上并不停止而是继续转录后续基因。如果在某一基因的依赖于的终止子之前发生无义突变，核糖体便从无义密码子上解离下来，翻译停止，核糖体不再进入到mRNA上无义密码子以后的位置上。于是就可以自由进入RNA并移动，直到赶上停留在终止子上的RNA聚合酶。结果使RNA聚合酶释放，不能再转录下游基因。,概念：基因表达的极性现象：在某些情况下同一转录单位里，由于一个基因的无义突变，阻碍了其后续基因表达的效应就称为基因表达的极性现象。除了无义突变可以导致极性现象外，插入序列IS1、IS2等DNA片段插入到操纵子的基因中也会发生极性现象。,因子也可发生突变，其效应的基本性质是使终止作用出现故障。突变常可

10、抑制极性效应，这是因为其突变很可能减弱了对无义密码子后面的中间终止子的作用，这样翻译的终止并不会使转录也停顿，且远离无义突变的DNA区段还可以被重新覆盖的核糖体继续翻译,(四)抗终止作用 因子的作用可以被抗终止因子所抵消，这样，RNA聚合酶便可通过终止子(依赖于因子的)继续转录后面的基因。这种现象称为抗终止作用(anti一termination)。,抗终止作用最有代表性的例子见于噬菌体的时序控制。噬菌体基因在裂解过程中的表达分前早期、晚早期和晚期3个阶段进行，其早期基因与晚期基因以终止子相隔。噬菌体侵入敏感细胞，首先借助宿主的RNA聚合酶转录前早期基因，由此获得的表达产物N蛋白是一种抗终止因子

11、，它与RNA聚合酶作用使后者越过左右两个终止子继续转录，实现晚早期基因表达。,三、原核生物RNA的加工(P233-235)四、SD序列与翻译效率核糖体结合保护降解法：测定mRNA 上核糖体起始蛋白质合成的部位。在抑制多肽链伸长的条件下，当翻译起始时，核糖体与mRNA的结合位点已形成稳定的复合体，于是加入核酸酶使未与核糖体结合的 mRNA的区段降解，而有核糖体结合区域则受到保护。,在细菌中受核糖体保护的起始序列约3540个碱基长，其中包含起始密码子AUG。在起始密码子上游约47个核苷酸之前还有一段富含嘌吟的5AGGAGG3短小序列，它可以与16S rRNA3端的 3UCCUCC5区段完全互补。m

12、RNA上的这段序列称为 Shine Dalgarno 序列（简称SD序列）。,SD序列与16S rRNA序列互补的程度以及从起始密码子AUG到嘌呤片段的距离也都强烈地影响翻译起始的效率。不同基因的mRNA有不同的SD序列，它们与16S rRNA的结合能力也不同，从而控制着单位时间内翻译过程中起始复合物形成的数目，最终控制着翻译的速度。,第二节 大肠杆菌乳糖操纵子的正负调控,一、操纵子与操纵子模型操纵子学说/操纵子模型：F.Jacob、J.Mond（1960）E.coli lac operon(1965诺贝尔医学生理学奖)操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本单元，由结构基因、操作子（O）和启

13、动子（P）组成。转录、翻译、合成蛋白 结合调节蛋白 结合RNA聚合酶,操纵子(operon)模型,调控蛋白的作用机制,注：R：Regulator P：Promoter O：Operator 正调控系统中的正调控蛋白又被称为无辅基诱导蛋白（apoinducer)负调控系统中的负调控蛋白又被称为阻遏蛋白（repressor),二、正调控与负调控调节基因 RNA 调节蛋白 正调节蛋白+操作子 结构基因转录、表达 基因失活，结构基因不表达（正控制/正调节）负调节蛋白+操作子 结构基因转录、表达 基因失活，结构基因组成型表达（负控制/负调节）,根据调节蛋白基因突变失活所产生的后果，可分：隐性的组成型表达

14、负控制系统 结构基因处于不可诱导状态正控制系统 根据辅因子（小分子）结合后调控效果，可分：开启调控系统中结构基因的转录活性 诱导 关闭调控系统中结构基因的转录活性 阻遏,操纵子调控系统的基本类型,可诱导负控制系统可诱导正控制系统可阻遏负控制系统可阻遏正控制系统,正调控与负调控并非互相排斥的两种机制，而是生物体适应环境的需要，有的系统既有正调控又有负调控；原核生物以负调控为主，真核生物以正调控为主；降解代谢途径中既有正调控又有负调控；合成代谢途径中一般以负调控来控制产物自身的合成。,如：大肠杆菌乳糖代谢的调控需要三种酶参加:.-半乳糖酶：将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖.渗透酶：增加糖的渗透，易于摄取

15、乳糖和半乳糖.转乙酰酶：-半乳糖转变成乙酰半乳糖大量乳糖时：大肠杆菌三种酶的数量急剧增加，几分钟即可达到千倍以上，这三种酶能够成比例地增加.乳糖消耗完：这三种酶的合成也即同时停止.,三、细菌的乳糖代谢可诱导系统,1.乳糖操纵子的负调控（negative control）,从1946年起及随后的10年，Jacques Monod、Joshua Lederberg、Francois Jacob以及Andre Lwoff 对乳糖代谢的遗传学和生物化学进行了系统的研究。,（1）乳糖代谢的可诱导性（induciable）,当培养基中有葡萄糖（glucose）时，细菌中代谢半乳糖（galactose）的酶

16、非常少。,（2）乳糖代谢系统的基因组成,乳糖（lactose）既是底物（substrate）又起到了诱导物（inducer）的作用。,乳糖操纵子（lac operon）,当培养基中有乳糖（lactose），而无葡萄糖时，细菌中专门代谢乳糖的酶类就迅速增加。,Joshua Lederberg为了研究乳糖代谢的三个酶的基因，分离了大量的突变体（lac-），并经过遗传作图发现它们是紧密连锁的：Z-Y-A,同时发现它们是被同时诱导转录的。,操纵子（operon）：,与乳糖代谢有关的几个酶的基因成簇（cluster）排列，形成一个共同的调节单位操纵子。,由结构基因（structural genes）和上

17、游相邻的控制区（regulatory region）组成。,lacZ：,编码-半乳糖苷酶（-galactosidase）,四聚体，分解乳糖。,i）结构基因（structural genes）,乳糖,半乳糖+葡萄糖,-半乳糖苷酶,lacY：,编码-半乳糖苷透性酶（permeasae）。,膜蛋白，将半乳糖转运到细胞中。,lacA：,编码-半乳糖苷乙酰转移酶（transacetylase）。,把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上。,二聚体。,ii）控制区,乳糖是如何诱导相关的酶合成的？,a.安慰诱导物（gratuitous inducer）,IPTG（isopropylthiogalactosi

18、de）是乳糖的类似物，能诱导乳糖代谢酶合成，但不会被分解。,IPTG的发现说明：诱导并不一定需要乳糖。,没有乳糖，代谢酶照样合成（不需要诱导）。,遗传作图发现：,这种突变（lacOc）的基因紧密连锁在结构基因的上游（operator region）。,另一个组成型突变（lacI-）作图的结果是在离结构基因不远处。,b.组成型突变（constitutive mutants）,（3）操纵子模型（Operon Model）,1960年，Jacob和Monod提出了操纵子模型，说明乳糖诱导代谢是一个负控制（negative control）。,获1965年Nobel生理学和医学奖,操纵子模型对乳糖诱导

19、效应的解释,i）要点：,lacI 编码了一个阻遏物（repressor），与结构基因附近的一个“假想”位置（命名为operator site）结合（binding），抑制了结构基因的启动子（promotor），从而抑制结构基因的转录。,该阻遏物能变构（allosteric）。即它还能与乳糖结合，改变构像而丧失了与operator DNA结合的能力，结构基因才能够转录表达。,ii）操纵子的组分,实际上，真正的诱导物是乳糖的异构体（isomer）异乳糖（allolactose）。,iii）操纵子的工作过程,iv）组成型突变,lacOc,lacI-,动画演示,Lac操乳糖操纵子.avi纵子,Lac操

20、纵子O突变,Lac操纵子I突变,Lac操纵子I超突变,对模型的遗传学验证,根据操纵子模型的原理，可以预测：,i）模型预测,a.lacI基因产物是个可扩散的（diffusible）蛋白。,b.O区（operator region）在调节过程中起作用，但不编码产物。,c.O区必须紧靠结构基因。,ii）PaJaMo实验验证,Pardee、Jacob、Monod设计了历史性的实验来检验他们的模型的预测是否正确。,a.实验原理,大肠杆菌的F因子（F factor）转化。,F 因子是E.coli 的一种质粒（plasmid）。F+菌株能通过结合（conjugation）把它的F 因子传给F-细胞。并且还能

21、把染色体的部分DNA也带过去。,b.实验过程,通过F因子，给lacI-或lacOc的突变菌输入野生型lacI或lacO基因，观察其对-半乳糖苷酶活性的影响。,实验1：,组成型突变lacI-lacZ+,F菌株F lacI+lacZ-,乳糖诱导型菌,说明F菌株的lacI+能弥补原菌株的lacI-缺陷。,即：lacI对lacZ是反式作用（trans-acting）。,组成型突变lacI+lacOc lacZ+,F菌株F lacI+lacO+lacZ-,组成型表达,实验2：,说明F菌株的lacO+不能弥补原菌株的lacOc缺陷。,即：lacO对lacZ是顺式作用（cis-acting）。,实验3,la

22、cI超突变（lacIs）编码的阻遏物不能与乳糖结合，所以总是结合在O区的DNA上，使lacZ不能表达。,野生型lacI+lacZ+,F菌株超突变F lacIs lacZ+,组成型不表达,说明超突变lacIs 编码的阻遏物能作用于野生型菌操纵子的O区。,利用超突变：,（4）操纵子模型的意义,Jacob和Monod1961年发表的操纵子理论是遗传学的的一个里程碑（landmark）。,他们所做的酶活性诱导测定对当时的生物化学同行来说都是个难题。,用遗传分析结果推论出分子生物学模型。,提出了蛋白质与DNA结合的概念。,描述了“阻遏物”的调节因子概念（尽管并不知道它是蛋白质还是RNA）。,当时人们刚知

23、道mRNA，对转录的细节一无所知。,（5）阻遏物的分离和鉴定,阻遏物的含量极少，每细胞不超过10份。,直到1966年，Walter Gilbert和Benno Muller-Hill从lacI的超量突变菌株中，利用透析（dialysis）的方法，通过IPTG与阻遏物的结合作用，分离到了这个蛋白质。,Gilbert及其同事又用放射自显影证明它能与lacO DNA结合。,分离,鉴定,放射性标记的阻遏物能与野生型O区结合,放射性标记的阻遏物不能与突变型O区结合,Lac 阻遏物的空间结构,两个binding domian:,四聚体聚合区,C,N,一个四聚体聚合区,阻遏物与DNA的结合,i）电镜观察,L

24、ac repressor,ii）X-ray分析,两个单体结合在一个完整的lacO区；,四聚体可以结合两个lacO。,iii）DNA测序分析,阻遏物所结合的DNA有26bp（-5+21）。位于RNA多聚酶结合部位的下游内部。,GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTT,ATG,mRNA,protein,RNA pol binding site,repressor binding site,对称轴,2.乳糖操纵子的正调控（positive control）,Jacob-Monod 模型没能回答一个关键性的问题：,为什么E.coli 在既含有葡萄糖（glucose）又含有乳糖的（lacto

25、se）的培养基（medium）中不启动lac 操纵子的转录？,Answers to this question emerged from molecular studies carried out long after publication of the operon theory.,（1）正调控因子（positive regulator）,在有些启动子上，RNA pol结合后并不能启动转录。必须一个激活因子（正调节因子）的帮助才能打开DNA双链。,CAP（cAMP activator protein）是lac operon的正调节因子。,（2）CAP的作用原理,cAMP与CAP结合，激活C

26、AP与lacP DNA结合。,CAP与DNA结合后增加了RNA pol与DNA结合，增加转录结构基因的能力。,cAMP是由ATP经过腺苷酸环化酶（Adenyl cyclase）的作用形成。,葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性。,ATP,cAMP,Adenyl cyclase,CAP-cAMP系统在半乳糖和阿拉伯糖操纵子中也起作用。,从而间接地抑制了Lac操纵子的转录。,（3）CAP与DNA的结合,lac操纵子中，CAP结合位点位于RNA pol结合位点的上游（-22bp）。,结合部位位置,不同的操纵子中，CAP的结合位置不同。,operator,CAP,promotor,结构基因,半乳糖,乳糖,阿拉

27、伯糖,结构基因,operator,promotor,CAP,operator,CAP,promotor,结构基因,以二聚体形式与DNA结合。使DNA弯曲90度。,结合形式,TGTGAGTTAGCTCACACACTCAATCGAGTG,结合处DNA的保守序列回文顺序,每一部分结合一个CAP。,第三节 其他类型的操纵子,一、具有双启动子的半乳糖操纵子半乳糖（gal)操纵子组成：2个互相重叠的启动子gal P1 和gal P2、3个操作子（CAP位点、2个阻遏蛋白位点(galOe、galOi）、3个结构基因）gal P1 依赖cAMP-CAP 转录始于S1 gal P2 阻遏蛋白调节开启 转录始于S

28、2,位于CAP位点内,位于galE内,乳糖代谢需要三种酶：半乳糖激酶（galactokinase,gal K）半乳糖转移酶（galactose transferase,Gal T）半乳糖差向异构酶（galactose epimerase,gal E）,正控制可诱导系统（第一系统）：gal P1、cAMP-CAP复合物、cAMP-CAP位点 S1无葡萄糖时：ATP cAMP cAMP-CAP复合物 结合CAP 有葡萄糖时：系统关闭 负控制可诱导系统（第二系统）：galP2、阻遏蛋白-半乳糖复合物、galOe、galOi S2 无半乳糖：阻遏蛋白结合操作子阻遏 有半乳糖：复合物构象改变开启（从S2

29、开始转录）,CAP位点,激活gal 操纵子，转录从S1开始，结构基因表达,galE galT galK,P2,S1,P1,S2,a.半乳糖操纵子结构示意图,cAMP-CAP galactose repressor,双启动子的半乳糖操纵子,cAMP-CAP,galOe、galOi,有G，有gal：1.阻遏 2.诱导 无G，无gal：1.诱导 2.阻遏：cAMP-CAP与阻遏蛋白竞争 无G，有gal：1.诱导 2.诱导：高水平表达 有G，无gal：1.阻遏 2.阻遏,二、阿拉伯糖操纵子的双向控制Ara操纵子是控制分解代谢途径的另一调控系统。特点：调节蛋白既可起正调控作用，又可起负调 控作用。组成：

30、araC基因编码调节蛋白AraC蛋白；：O1不参与调控；O2：AraC蛋白负调 控结合位点；：调节位点，CAP-cAmP复合物结合位点，AraC蛋白正调控结合位点。,调控：.诱导物阿拉伯糖和cAMP同时存在：Ara与AraC蛋白复合物结合在位点，CAP-cAmp复合物结合I位点，基因转录开启；.在没有诱导物阿拉伯糖和cAMP时：AraC蛋白同时与I和 O2结合，DNA构型发生改变，形成一个紧密的环结构，抑制表达。,三、色氨酸操纵子的转录调控及衰减作用 1色氨酸操纵子模型：由雅各布（Jacob F.）和莫诺（Monod J.）提出，具有合成代谢途径典型的操纵子模型。操纵子：包括色氨酸合成有关的5

31、种酶的结构基因；大量色氨酸时：大肠杆菌5种酶的转录同时受到抑制；色氨酸不足时：这种酶的基因开始转转录；色氨酸：作为阻遏物而不是诱导物参与调控结构基因的转录。trp操纵子是一个典型的可阻遏操纵元模型(repressible operon)。,三、细菌的色氨酸代谢的调控,1953年，Monod和同事们发现了一个可抑制型操纵子（repressible operon）。,WT E.coli,酶,tryptophan,合成,tryptophan,但当培养基中有足够量的色氨酸时，细菌不再产生合成色氨酸所需要的酶类。,野生型细菌能表达合成氨基酸和其它生物大分子的酶。,1.色氨酸合成代谢的基因和酶类,与色氨酸

32、合成相关的基因有5个，编码3个酶：,trpA：色氨酸合成酶的亚基,trpB：色氨酸合成酶的亚基,trpC：吲哚甘油磷酸合成酶,trpD：邻氨基苯甲酸合成酶组分,trpE：邻氨基苯甲酸合成酶组分,2.色氨酸合成的生化途径,邻氨基苯甲酸合成酶,吲哚甘油磷酸合成酶,色氨酸合成酶,邻氨基苯甲酸,磷酸核糖基邻氨基苯甲酸,CDRP,吲哚甘油-磷酸,色氨酸,分支酸,3.色氨酸操纵子（trp operon）,attenuator：衰减子,4.色氨酸操纵子的调节模型,Jacob和Monod提出了一个与乳糖操纵子相似的模型，解释色氨酸合成的抑制作用。,关键：,认为存在一个在正常情况下无活性的阻遏物（normall

33、y inactive repressor），单独状态下不能与operator结合。,但它能与色氨酸结合后改变构像，才能与operator DNA结合，抑制转录。,色氨酸操纵子模型结构：5种结构基因：trpE、D、C、B、A；调控结构：启动子、操纵子、前导序列、弱化子；阻遏物trpR基因：与trp操纵子相距较远；,2.色氨酸操纵子的负调控：.阻遏调控：trpR基因编码无辅基阻遏物 与色氨酸结合 形成有活性的色氨酸阻遏物 与操作子结合 阻止转录；色氨酸不足：阻遏物三维空间结构发生变化，不能与操作子结合，操纵元开始转录；色氨酸浓度升高：色氨酸与阻遏物结合，空间结构发生变化，可与操作子结合，阻止转录。

34、,trp与repressor结合后，使repressor的结构稍稍张开，能够结合到DNA的沟里。,动画演示,Trp操纵色氨酸操纵子.avi子,5.色氨酸操纵子的衰减（attenuation）调节,(1)Charles Yanofsky及其同事们的观察,Yanofsky、Bertrand等在分析trp 操纵子转录的实验中发现：在有高浓度色氨酸的情况下，一般只转录一段140bp短序列mRNA（并非一点都不转录），在转录到结构基因前被中止了衰减。在无色氨酸或低浓度色氨酸时，能一直转录出完整的mRNA。,（2）衰减原理,在第一个结构基因trpE与操纵区trpO之间有一段162bp的DNA。,Yanof

35、sky等提出一个衰减模型：,关键：前导序列mRNA的二级结构。,前导序列（leader sequence）trpL,茎环结构（hairpin structure）,前导序列的转录物内部有4个配对区，彼此都能配对:1区2区配对、3区4区配对，能形成两个茎环结构。第二个茎环后紧接寡聚U，类似于转录终止信号。,3-4区配对形成类似与内终止子的结构。,如果2区和3区配对，两个茎环变换成另外一个茎环结构。第二个茎环不能形成，不再成为转录终止信号。,茎环变换,前导顺序的+5060bp有2个连续的色氨酸密码子（UGGUGG）。,连续的色氨酸密码和终止密码,下游+70处有一个终止密码UAG。,GGU UGG

36、UGG CGC ACU UCC UGA AA,50,60,70,Trp,stop,1区,核糖体占据空间包含了1区,当细胞中色氨酸水平很低时,由于缺乏trp-tRNAtrp，核糖体会在色氨酸密码处此延滞（stalling）。,核糖体占据了第一个茎环，在4区转录前，2区与3区就已经配对，形成一个茎环。转录出的4区呈单链状态，下游的结构基因得以转录。,细菌核糖体能占据30-35nt mRNA。,当色氨酸充足时：,后一个茎环的结构起到转录终止信号作用，转录提前终止衰减。,核糖体顺利通过色氨酸密码，但停在1区和2区之间的终止密码UAG上，占据了1区和2区的部分区域，3区与4区配对，能形成后一个茎环。,色

37、氨酸在E.coli的蛋白质中属于稀有氨基酸。,衰减只能允许10%的RNA pol继续前进。,动画演示,色氨酸操纵子的衰减作用,三、其他操纵子的衰减现象性,苏氨酸（threonine）、组氨酸（histidine）、亮氨酸（leucine）、苯丙氨酸（phenylalannine）操纵子都有类似的leader sequence作衰减控制区域。,由于需要核糖体同时配合，衰减调控只有在原核细胞中才能发生。但也是个普遍现象。,.弱化子调控：当有色氨酸存在而trp操纵子受抑制时，仍有一段前导序列发生转录，可能存在另一种的机制来抑制trp操纵元的转录。色氨酸高浓度存在时，转录的前导序列140bp长，其中有

38、一28bp的弱化子区域；形成发夹结构，为内部终止子，RNA酶从DNA上脱落，不能转录；色氨酸低浓度或不存在时，RNA聚合酶能通过弱化子区域，转录完整的多顺反子mRNA序列；,问题：弱化子如何进行调控？前导序列可翻译出一段14个氨基酸的短肽，在该短肽的第10、11位置上是两个色氨酸密码子；两个密码子之后是一段mRNA序列，该序列可分为四个区段，区段间可互补配对，形成不同的二级结构。原核生物为边转录边翻译，前导序列中核糖体位置决定形成哪种二级结构,从而决定弱化子是否可形成终止信号。,.当有色氨酸时，完整翻译短肽 核糖体停留在终止密码子处，邻近区段2位置 阻碍了2,3配对 使3,4区段配对 形成发夹

39、结构终止子 RNA酶在弱化子处终止，不能向前移动。,.如缺乏色氨酸，核糖体到达色氨酸密码子时 由于没有色氨酰tRNA的供应 停留在该密码子位置，位于区段1 使区段2与区段3配对 区段4无对应序列配对呈单链状态 RNA聚合酶通过弱化子，继续向前移动，转录出完整的多顺反子序列。,衰减作用的生物学意义 从衰减机制的分析来看，它不仅能够把几种水平如DNA和RNA的构象变化、mRNA上内部终止(衰减)子的重建以及核糖体上tRNA对终止密码的识别等统一起来，严格控制表达，而且衰减子还可依细胞内某一氨基酸水平的高低而行止。所以它是一种应答灵敏、调节灵活的多重调控方式。,就像在色氨酸操纵子中，阻遏作用与衰减机

40、制一起协同控制其基因表达，显然比单一的阻遏负调控系统更为有效。一方面，当有活性的阻遏物向无活性阻遏物的转变速度极低时衰减系统能更迅速地作出反应，使色氨酸从较高浓度快速下降到中等浓度；,另一方面，若外源色氨酸浓度实在太低，细菌本身又没有其他的内源性色氨酸合成体系，以致细菌难以支持自身的生长时，就需要有衰减体系加以调节通过不终止mRNA的合成来增加Trp酶的合成从而提高内源色氨酸的浓度。,可见：衰减机制在控制基因产物的量和产物种类的配比上起着快速灵敏的调节作用，使操纵基因表达更为精密、高效。,一、噬菌体的基因组及早、晚期转录 一）裂解的级联调节 噬菌体长48502nt 共61个基因，其中32个较为

41、重要 溶原化周期(LYSOGENIC)裂解周期(LYTIC),第四节 噬菌体基因组的表达调控,噬菌体的早，晚期转录,二反终止作用,第二节 溶原化途径的维持,一、CI蛋白功能 清晰的噬菌斑（Clear plaquea）RM：repressor maintenance 二CI蛋白的结构 分子量为27KDa，具有两个功能区(1)N端功能区，192aa，操纵基因结合区;(2)C端功能区,132236aa，负责形成二聚体。,C蛋白 的结构,UV可激活Rec蛋白，活化的Rec蛋白可剪切C蛋白,C蛋白的N端含有5个螺旋,第2和第3个螺旋形成HTH(螺旋转角螺旋),C蛋白二聚体N端的HTH和DNA结合，螺旋3

42、位于DNA的大沟,C蛋白与DNA结合的信号,螺旋2上具有正调控区，此区靠近RNA聚合酶及DNA上的磷酸化位点,C蛋白的合成是通过C蛋白激活和RNA聚合酶在PRE上的转录,三.阻遏物与DNA的结合及调机制 螺旋转角螺旋(helix-turn-helix,HTH)识别螺旋（recognition helix）四.反义RNA调控 1.PAQ 抑制 Q 基因 表达 2.P RE 抑制 cro 基因 表达五.反向调节,游离噬菌体 P L启动子转录的RNA是否会产生 sib 位点？游离噬菌体 P I启动子转录的RNA是否会产生 sib 位点？原噬菌体的 P L启动子转录的RNA是否会产生 sib 位点？,

43、第四节 Cro蛋白的功能,小分子二聚体（每个亚基为9KDa）具有两种效能:(1)阻止启动子PRM转录；(2)也可抑制从PL和PR起始的早期基因的表达。,第五节 溶原化和裂解周期平衡,进入溶原化1.营养耗尽 未发现cAMP-CAP对基因表达的调控 对宿主:抗溶原基因hfl 水解C蛋白 cAMP-CAP himA 整合酶亚基2.感染复数(multiplicuty of infection,MOI)过高 C：a.启动PRE b.启动P i c.启动P AQ C单体无活性，形成寡聚体才有活性,第五节 DNA重组对基因表达的调控,在某些细菌中，特定基因的表达与基因组内DNA重排有关。如沙门氏菌具有运动鞭

44、毛，它是由许多相同的鞭毛蛋白亚基装配而成。沙门氏菌含有两个不同的结构基因H1和H2，它们编码不同的鞭毛蛋白。,H1基因表达则产生Hl型鞭毛蛋白，这时细菌就处于I相(Phase l)；若是H2基因表达就产生H2鞭毛蛋白，细菌处于相(Phase)。处于I相的细菌生长时，其中少数细菌以103每次细胞分裂的频率而自发转变为相细菌；处于相的细菌也以同样的频率转变为I相细菌，这一过程称为相变(phase wariation),H2基因与另一个基因rH1紧密连锁，同属于一个操纵子。并协同表达。rHl编码Hl基因的阻遏蛋白。当H2和rH1表达时，由于rHl阻遏物阻止了H1基因的表达，就只合成H2鞭毛蛋白。如果

45、H2基因和rHl基因被关闭不表达，这时H1基因便表达，合成Hl鞭毛蛋白。,相变的控制取决于含H2和rHl基因操纵子的启动基因所处的状态。含有启动基因在内的上游DNA长995核苷酸对，两边各有一段长14核苷酸对的重复，即IRL和IRR。H2基因的起始密码子开始于IRR右边的第17核苷酸对处，IRL和IRR之间的序列含有基因hin，它的产物是相变酶，可催化这段995核昔酸对序列发生包括hin基因在内的倒位。,另外，在倒位前这段序列的第950一983核昔酸对区还含有一个促进下游基因转录的启动子(p)，它使H2和rH1基因表达，于是细胞处于相。当发生倒位以后，这个启动子便被移到序列的另一方，且方向改为

46、朝左，H2和rH1失去启动子而失活，这时细胞内没有rH1阻遏蛋白，因而H1基因表达，细胞转变成I相。一旦这段DNA倒位依复原状，细胞又将转变为相。,沙门氏菌H1或H2基因选择性表达及其调控,这种鞭毛相的变化为何不能用基因突变来解释？因为第一这种变化只发生在两种鞭毛蛋白类型的相互转变，而沙门氏菌的鞭毛蛋白类型有十几种之多，如果是基因突变，那么也应出现其他类型的鞭毛蛋白。再者，这种变化发生的频率很高，从每代每105个细胞中改变一个到每代每103个细胞中改变一个；第三，实验证明：相变的实质是Hl 或H2基因选择性表达的结果。,1 翻译过程中的自我调控,自体调控：一种蛋白质或者RNA调控自身的表达。通

47、过阻抑蛋白结合到mRNA的靶区域上阻止核糖体识别区以达到阻遏的功能。特点：每个自体调控专一，调控蛋白只作用于负责指导自身合成的mRNA。,阻抑蛋白对翻译起始的调控,第六节 蛋白质合成的自体调控,一、RF2合成的自体调控 CUU U GAC 25 26RF2充分时，核糖体翻译其mRNA到达此终止密码子，被RF2识别，翻译终止（不完全肽链，无RF2活性）RF2不足时，核糖体翻译其mRNA到达此终止密码子，发生移位作用，跳过U，不被RF2识别，翻译继续，直到此基因的最后的终止密码子，在RF1的作用下，形成完整肽链（具RF2活性）,二、核糖体蛋白质合成的自体调控 实验分析：核糖体蛋白质与rRNA的结合

48、部位同编码核糖体蛋白的mRNA的结合部位有同源性，而且某些核糖体蛋白的mRNA其部分二级结构与rRNA的部分二级结构相似，二者都能与起调控作用的核糖体蛋白质相结合，只是rRNA的结合能力强于mRNA。然而，一旦rRNA的合成减少或停止，游离的核糖体蛋白开始积累。这些多余的核糖体蛋白就会与本身的mRNA结合，从而阻断自身的翻译，同时也阻断同一多顺反子mRNA下游其他核糖体蛋白质编码区的翻译，使核糖体蛋白质的合成和rRNA的合成几乎同步地停止。但rRNA的合成是在转录层次的调节，而核糖体蛋白质的合成则是在翻译层次的控制。,三、严谨反应与核糖体合成的调控 概念：严谨反应（stringent resp

49、onse)是指细菌生长在不良营养条件下时，由于缺乏任何一种氨基酸等因素所导致的蛋白质合成突然下降,tRNA合成突然停止等一系列反应。,表 与mRNA起始区结合抑制翻译的阻遏蛋白,参与构成基因表达装置的蛋白质的合成的自体调控,蛋白质富集会抑制其自身及一些相关基因产物的进一步合成。,P32更容易与单链DNA结合，不影响其合成。,缺乏单链DNA或者有过剩P32存在时，此蛋白就阻止其本身的mRNA的翻译。此作用是由P32直接地结合在mRNA上阻断了翻译的起始，有可能就结合在核糖体结合位点周围的A-T丰富区。,图 过量的基因32 的蛋白P32与自身的mRNA结合抑制核糖体翻译起始,T4噬菌体蛋白p32合

50、成的自体调控,自动调节r-蛋白在rRNA上的结合位点比在mRNA上的强。,只要任何游离的rRNA是有效的，新合成的r-蛋白将与之结合装配成核糖体。若无游离的r-蛋白结合于mRNA上，翻译将持续。当rRNA合成降低或停止，游离的r-蛋白就开始积聚。然后r-蛋白有效地结合到它们自己的mRMA上，阻遏进一步的翻译。通过rRNA水平的控制，细胞控制了各种核糖体成份的生产。,图 结合于rRNA的r-蛋白的自我调控,初生蛋白,（1）结构：E.coli的RNA噬菌体MS2，R17，f2和Q最简单的病毒。基因组长36004200nt，只含4个基因：CP(coat protein)含129aa,MW为13.7K