第十五章现代免疫学技术.ppt

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1、第十四章 现代免疫学技术,第一节 免疫微粒技术,免疫微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体，包被上具有特异性亲和力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫微粒，用于免疫学及其他生物学检测与分离的一项技术。,作为载体的微粒通常是以某种高分子有机单体为原料经过高分子聚合方法制备而成。由于制备材料及工艺不同，现已制成惰性微粒、活性微粒、磁性微粒及标记微粒等四大类微粒，数量多达几十种。将制备好的微粒与抗原(或抗体)经物理吸附、化学偶联及生物素亲合亲桥联法等方法形成免疫微粒，广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、分离与纯化、细胞标记与识别等。近年来，微粒技术在核酸分子杂交、D

2、NA与RNA的分离及PCR等研究领域亦显示出广阔的应用前景。,胶乳微粒免疫检测技术,胶乳微粒免疫检测技术是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的一种非放射性均相免疫测定法，可以对各种微量的抗原物质和小分子半抗原进行精确的定量测定。根据特异性抗体致敏的胶乳微粒，与待测标本中的相应抗原相遇时发生凝集反应，胶乳凝集程度与被测物的浓度呈函数关系，由此可测出标本中待测物的含量。测定方法主要有粒子计数法和浊度法两种。,免疫磁性微粒分离与纯化技术,磁性微粒(MMS)是以金属离子为核心，外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。在液相中，受外加磁场的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。经过特异性抗

3、体包被制成免疫MMS，与检样中的抗原结合形成免疫MMS靶分子(或靶细胞)复合体，通过外加磁场的作用即可与其他成分分离开来。再以适当方式使复合体解离，在磁场吸引下除去游离的免疫MMS，即可获得纯化的靶分子或细胞。,免疫微粒技术,免疫磁性分离原理示意图,细胞裂解液浓度调整免疫磁性微球吸附洗涤解离超滤凝胶过滤-2b干扰素纯品,磁铁,免疫磁性微球,-2b干扰素,杂蛋白,细胞裂解液,基因工程-2b干扰素的免疫磁性分离系统的开发,10ml干扰素裂解液（蛋白浓度4mg/ml）20倍稀释后加入抗体致敏的磁性微球10ml用50ml PBS洗涤3次加入甘氨酸-HCl裂解液（pH2.8）20ml超滤浓缩得纯化-2b

4、干扰素收率60%，纯度80%，生物学活性108 IU/mg,第二节 免疫组织化学技术,免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质。免疫组化技术由免疫荧光技术逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。,免疫组织化学的全过程包括：,抗原的提取与纯化；免疫动物或细胞融合；制备特异性抗体以及抗体的纯化；将显色剂与抗体结合形成标记抗体；标本的制备；免疫细胞化学反应以及呈

5、色反应；观察结果。,免疫荧光细胞化学技术,免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针，对检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)，进行定位、定性和定量的目的。,免疫酶细胞化学技术,免疫酶技术就是用酶标记已知抗体(或抗原)，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原(或抗体)，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、产生显色反应，识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的。免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，为免疫病理研究开辟了一条新途径。另外，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进

6、行免疫电镜观察,抗体与靶抗原结合之后，形成的抗原抗体复合物在显微镜下是不可见的，如将抗体与某种显色剂偶联，抗原与抗体结合形成的复合物就由不可见而成为可见，从而可以确定组织中是否存在某种抗原。,第三节 免疫电子显微镜技术,免疫电镜技术(Immune electron microscopy，IEM)是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。,免疫电镜技术常用标记原理 I,铁蛋白

7、标记 铁蛋白是一种含铁23，分子量约750kDa，直径为1214nm的球形蛋白。其核心是由4个亚基组成的高电子密度氢氧化铁胶态分子团，外层由24个蛋白质亚单位组成近似球形的外壳。在电镜下，铁很容易和其他粒子相区别，显像清晰。可通过双功能交联剂可与抗体、SPA等共价结合；用于免疫电镜检测的优点是标记物呈颗粒状，分辨率高。但其缺点是Fe的分子量太大，难以透过细胞膜和组织，只适用于细胞表面抗原定位；而且Fe染色标本只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。,酶标记,将酶标抗体用于免疫组化技术，以HRP标记抗体，通过H2O2DAB底物系统被酶分解的呈色反应，来显示抗原抗体反应部位。DAB分解产物为不溶

8、性的棕色吩嗪衍生物，经过OsO4处理后变黑，具有高电子密度，十分适合于电镜观察。而且HRP的分子量(40kDa)比铁蛋白(750kDa)将近小20倍，酶标抗体较易透过经适当处理后的组织细胞膜，能用于定位细胞内抗原。但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物(铁蛋白胶体金)高。,免疫电镜技术常用标记技术 II,酶标记,胶体金标记,胶体金是氯金酸(HAuCl4)的水溶胶颗粒，如同铁蛋白一样具有高电子密度，在电镜比铁蛋白颗粒更致密，易于辨认，定位比酶反应物精确。胶体金容易和多种大分子物质、包括抗体、A蛋白、凝集素等结合。根据制备方法不同，可以得到直径在3150nm之间的各种大小的胶体金颗粒；分别使用不同直

9、径的胶体金颗粒制备标记物，可以在同一标本片上显示两种或多种抗原物质，即所谓双标记或多标记。胶体金标记物还可代替铁蛋白作为扫描免疫电镜的标记物。因此，胶体金成为当前免疫电镜工作者最感兴趣的标记物。,免疫电镜技术常用标记技术 III,胶体金标记,凝集素标记物,凝集素是一类从各种植物种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白。因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。常用的为植物凝集素有刀豆素A、麦胚凝集素、植物血激素、花生凝集素等。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力因此，凝集亲可以作为

10、研究细胞膜结构的探针。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其生物活性，可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究工作。,第四节 流式细胞术,流式细胞仪(Flow cytometer，FCM)能快速、精确地测量通过检测区液流中的细胞、大分子、乳胶滴或其他粒子。流式细胞术是应用一个激光和有关的光学检测系统来收集这些信号以供分析。为免疫学、肿瘤学、细胞遗传学、病理学、放射生物学、细胞生物学和生物医学研究提供强而有力的手段。FCM主要可定量分析细胞表面和细胞内抗原，以及对细胞分子水平的核酸含量的测量，预示各种病理状态下细胞的生物行为。FCM是集现代电子物

11、理技术、激光技术、电子计算机技术于一身的先进科学仪器，开创了荧光技术的又一个崭新的领域。,流式细胞仪的细胞分析原理：,待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室。流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱，进入流动室。被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照时后发出荧光，被荧光光电倍增管接收，实现了细胞的定量分析。再通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现了细胞的分选。,流式细胞仪,第五节 免疫印迹技术,免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗

12、体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)或非变性电泳(NativePAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。,Western blot method,第六节 酶联免疫分析技术,免疫技术为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。其基本原理是先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其

13、免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。,酶联免疫分析的基本原理和方法类型,ELISA可用于测定抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤不向，有以下三种类型的常用方法。间接法 双抗体夹心法 竟争法,间接法,此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。,双抗体夹心法,此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体加入待检标本(含相应抗原)与之结合

14、。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。,竟争法,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。,ELlSA方法的技术要点 I,与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)，由于载体不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品为载体一般多采用物理吸附法。除载体的理化性质外，受缓冲液的离子强度、pH值、包被时的温度和时间等多种因素的影响。用抗原或抗体包被后。固相载体表面往往尚残留少

15、量未饱和的吸附位点，产生非特异吸附，导致本底偏高。为此常用15BSA，或含520小牛血清的PH9.6碳酸盐缓冲液注满凹孔，37作用1h，可以消除此种干扰。这一过程称为封闭(blocking)。,固相载体和免疫吸附剂的制备,ELlSA方法的技术要点 II,抗原和抗体,用于制备酶标记物和包被固相载体的抗原要求纯度高，抗原性完整；抗体需特异、效价高、亲和力强，并具有较高的比活性。如将抗体IgG用木瓜蛋白酶水解为Fab片段，再与酶连接，可以减少非特异性吸附，检测效果更佳。McAb的应用，进一步提高ELISA法的特异性和灵敏度。使用针对抗原分子中不同决定簇的两种McAb分别作为固相抗体和酶标抗体用于双位

16、点夹心法，简化了操作程序。通常采用特异性较高的McAb作为固相包被抗体，与酶标记的多克隆抗体相结合进行检测，结果更为满意。,在ELISA法中，用于标记抗体或抗原的酶与免疫酶组织化学技术基本上相同。但所用底物被酶裂解后，应能生成可溶性有色产物，适合用分光光度计(酶标仪)测量光密度值，籍以定量测定样品中待捡抗原或抗体的含量。,ELlSA方法的技术要点 III,常用的酶及其底物,辣根过氧化物酶(HRP)OPD,TMB碱性磷酸酶(AP)PNP半乳糖苷酶(Gal)NPG葡萄糖氧化酶(GOP)PAP,第七节 胶体金试纸条技术,胶体金标记技术(Immunogold labeling technique)是以

17、胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术.胶体金是由氯金酸在还原剂等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团相互吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合。,control,test point,HCG test strip,胶体金标记试纸条,Ab:Goat anti-mouse IgG,Immunogold labeled mouse anti-Ag IgG,Ab:mouse anti-Ag IgG,其他免疫学技术,免疫PCR技术免疫磁性捕获PCR技术噬菌体展示技术 噬菌体模拟抗原表位 噬菌体抗体库技术,下一次课程为:免疫标记技术,