第二十章毛细管电泳法.ppt

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1、第一节 概述,电泳（Electrophoresis)是指溶液中带电粒子在电场的作用下向与自身带相反电荷的电极移动的现象。将电泳发展成为分离技术应归功于Tiselius的工作。他于1937年建立“移界电泳（moving boundary electrophoresis)”，成功地将人血清中的蛋白质分为白蛋白、和球蛋白，这项工作成为蛋白质化学发展的基础，因此Tiselius本人荣获1948年诺贝尔化学奖。,高效毛细管电泳,经典电泳法散热差，分离电压受到限制。1981年，Jorgenson和Lukacs发表了在毛细管电泳发展史上具有划时代意义的工作，他们采用75m内径的石英毛细管做为分离室，紫外柱上

2、检测的方法，在30kv的分离电压下分离丹酰化氨基酸，柱效达到40万个理论塔板。他们的工作为毛细管电泳的发展奠定了基础。,James W.JorgensonNorth Illinois University化学系教授,第二节 基本理论,一.电渗,电渗（electroosmosis)是毛细管电泳分离理论中最基本的概念之一。电渗是指在电场作用下，毛细管中或固相多孔物质内，液体沿固体表面移动的现象。电渗与固液两相界面的双电层有着密切关系。,电渗速度uos以下式表示：,石英毛细管壁上的硅羟基在水溶液中发生电离，所产生的SiO-负离子使毛细管壁带负电荷。溶液中的抗衡离子靠静电吸附和分子扩散在固液界面上形成

3、双电层（electric double layer)，双电层包括紧密层和扩散层。,HPLC由于压差产生抛物线型的流体流速轮廓。电渗流的流速轮廓是一个平面，在毛细管中如同瓶塞一样流动，不存在径向的流速梯度。这是毛细管电泳分离柱效高于HPLC的原因之一。,在电场作用下，固液两相间的相对运动发生在紧密层与扩散层之间的滑动面上。由于离子的溶剂化作用，当形成扩散层的离子在电场中移动时，携带着液体一同移动，因此产生电渗流（electroosmotic flow,EOF）,缓冲液pH对电渗流的影响随着pH的增大，石英管壁表面的硅羟基解离度增加，界面有效电荷密度增大，EOF随之增大。,阳离子型的表面活性剂使电

4、渗流发生反转 a.无表面活性剂存在；b阳离子表面活性剂在毛细管壁表面的吸附，抵消了原来的负电荷，使电渗迁移率0；c.继续增大阳离子表面活性剂的浓度，阳离子表面活性剂分子通过非极性链疏水相互作用，在毛细管柱表面形成双分子层，使电渗流反转.,在缓冲液中加入有机添加剂，如甲醇、异丙醇等，或水溶性高分子物质，对EOF也有较显著的抑制作用。,电泳（electrophoresis）是指溶液中带电粒子（离子）在电场中定向移动的现象。电泳迁移速度 uep 为：式中 电泳迁移率（电泳淌度）（electrophoresis mobility)（m2/V.s）V毛细管柱两端施加的电压,L毛细管柱长,二.电泳,在空心

5、毛细管中一个粒子的淌度可近似表示为：,三、表观淌度,由于电渗流速度大大高于电泳速度，所以，不管正离子、负离子还是中性分子，均随电渗流移动。,物质在毛细管中的保留时间为：Ld为毛细管柱进样端至检测窗口的距离（有效长度）,四、分离效率和谱带展宽（一）理论板数和板高,毛细管电泳分离柱效方程,从分离柱效方程可知：（1）分离电压V,n（2）V一定时，Ld/L,n（3）扩散系数D,n；大分子的D小，故CE对大分子分离柱效高。,（二）引起区带展宽的因素分子扩散焦耳热 电流通过毛细管中的电解质溶液时会产生焦耳热，使毛细管内及周围温度分布。,由于毛细管柱中沿径向存在一个抛物线型的温度梯度，由此引起介质的粘度在径

6、向上的梯度分布，进而引起径向上的电泳速度梯度。,3.吸附产生原因：（1）阳离子溶质和带负电的管壁的离子相互作用（2）疏水作用。对于生物大分子，如碱性蛋白和多肽等，吸附严重时可能导致测不到信号。因此，生物大分子分析时常需用涂层处理的毛细管柱。4.进样（过载）5.电泳样品区带与周围电解质溶液间的电导率差，从而导致峰形展宽。,分离度是指将淌度相近的组分分离的能力,分离度也可表示为柱效的函数：,讨论：分离度是下列因素的函数：外加电压V；有效柱长与总长度之比（Ld/L）；电泳有效淌度差；电渗淌度,五、分离度,第三节 毛细管电泳的主要分离模式,毛细管区带电泳（capillary zone electrop

7、horesis，CZE）胶束电动色谱（micellar electrokinetic chromatography,MEKC)毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis,CGE)毛细管等速电泳（capillary isotachophoresis,CITP)毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focus,CIF)毛细管电色谱（capillary electrochromatography,CEC),一、毛细管区带电泳（CZE）,毛细管电泳最基本的分离模式。背景电解质是缓冲液，分离是基于样品中各个组分间质荷比的差异。有时需在缓冲液中加入一定

8、的添加剂，用以提高分离选择性，改变电渗流的大小、方向或抑制毛细管壁的吸附等。在CZE中，影响分离的操作条件为：分离电压 背景电解质种类、浓度和pH 添加剂种类和浓度,分离效率与电压间存在极大值。极大电压通常也是最佳工作电压。在实际分离中，如果所用的毛细管很细或缓冲液的电导很低，极大电压可能会超出仪器范围，此时没有最佳电压，可选择仪器允许的最大输出电压。当毛细管较粗或缓冲液电导较高时，极大电压可能很小，若此时分离度很高，也可选择大于极大值的电压进行分离。,1.分离电压,毛细管的温度不仅影响分离的重视性，而且影响分离效率。温度选择应考虑热效应、分析重现性、分离效率和分离介质对温度的限制等因素。温度

9、的确定也应通过实验，多数情况下，在2030之间进行电泳，能获得良好的分离效果。可根据初步分离结果调整温度。不少糖类样品需要高于室温的分离环境，一些样品如蛋白等则可能需要低于室温的分离条件。,2.分离温度,对背景电解质的要求：在所选择的pH范围内有足够大的缓冲容量。在检测波长处的吸收低。自身的淌度低，即分子大而荷电小，以减少电流的产生。应使被测组分带合适的电荷量，以实现有效进样和有合适的电泳淌度。尽可能采用酸性缓冲溶液，在低pH下，吸附和电渗流值都很小。与毛细管种类匹配，涂层毛细管只能在一定pH范围内使用。,3.背景电解质,在CZE中，常用于毛细管电泳的缓冲溶液有硼砂、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐

10、和醋酸盐等。缓冲体系的pH值要求与样品的性质有关，通常酸性组分的分离选择在碱性条件下进行，而碱性组分则选择酸性介质分离，蛋白质、多肽、氨基酸等两性物质，可选酸性(pH2)也可选碱性(pH9)分离介质。糖类样品通常在pH911之间能获得最佳分离，羧酸或其它样品多在pH59之间选择分离条件。,pH的选择也和毛细管种类有关，很多涂层毛细管只能在一定pH范围内使用，如聚丙烯酰胺涂层毛细管，只能在pH49范围内使用，否则涂层易水解失效。在相同的pH下，不同缓冲体系的分离效果可能相差很大，一般来说，能与样品发生相互作用的试剂可能是最好的。如分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟

11、基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸盐缓冲体系也适用于其它含邻羟基或多羟基的化合物分离。,为了选择合适的pH值，需要pH调节剂调整介质的酸碱性。由于多数缓冲试剂属酸性物质，如磷酸，所以pH调节剂主要是碱类，常用的pH调节剂有NaOH、KOH、Tris等。有时也可考虑用胺或醇胺等有机碱，如乙醇胺、乙二胺。如果缓冲试剂为碱类，则可用酸作为调节剂，尽量使用弱酸，如 H3PO4。缓冲剂及调节剂的浓度对改善分离、抑制吸附、控制焦耳热等均有影响，一般缓冲试剂的浓度控制在10200mmol/L，有时为了抑制蛋白质等的吸附作用，可用高达500mmol/L的浓度（此时应减少分离电压）。电导率高的缓冲试

12、剂如磷酸盐和硼酸盐等，一般控制在20mmol/L，电导小的缓冲试剂如硼酸其浓度可在100mmol/L以上。,如果缓冲体系经各种参数优化后仍无法给出良好的分离结果，可以加入添加剂以改善分离。添加剂种类较多：1.无机电解质（NaCl、KCl）2.有机溶剂（如甲醇、乙腈）3.非电解质高分子（纤维素、多糖、聚乙烯醇、Triton X-100)4.功能性添加剂（手性冠醚、环糊精等）,二、胶束电动色谱（MEKC）,在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂（如SDS），当表面活性剂浓度超过其临界胶束浓度时，则形成亲水胶束，胶束具有疏水内核,外层带负电荷。溶质分子则在极性缓冲液与胶束中心的非极性相（假固定相）之间有一

13、定的分配。中性分子因其本身疏水性不同，在两相中分配存在差异。在电渗流作用下，胶束携带溶质一起前行，疏水性强的溶质和胶束结合得较牢，流出慢。不同分子在两相中的分配差异是MECC分离的基础。,常用的阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠（SDS）、N-月桂酰-N-甲基牛磺酸钠（LMT）、牛磺脱氧胆酸钠（STDC）等。阳离子表面活性剂最常用的是季铵盐，如十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等。非离子型表面活性剂有3-3-(氯化酰胺基丙基)二甲基胺基-1-丙基磺酸酯（CHAPS）等。另外，还有手性表面活性剂，如胆酸、毛地黄皂苷、十二烷基-N-L-缬氨酸钠等。,表面活性剂选择时应

14、考虑以下因素：（1）经济易得（2）水溶性好（3）紫外吸收背景越低越好（4）不与样品发生破坏性作用（5）所形成的胶束足够稳定,碳链较短的阴离子表面活性剂为优先选择对象。SDS易得、紫外吸收低，最为常用。如经浓度、缓冲溶液及pH优化，分离仍不佳，再换具有不同碳链长度或结构的其它阴离子表面活性剂。若结果仍不好，应考虑使用阳离子或中性、两性表面活性剂，如CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、Triton X-100等。应注意：阳离子表面活性剂可能会改变电渗流方向。胶束修饰：添加重金属离子可改变胶束表面的电荷数量；使用混合表面活性剂可调节分离度或峰分布；加入另一种胶束，如采用多相体系（水胶束环糊精），利用多

15、种作用改善分离。,三、毛细管电色谱（CEC）,以微填充柱作为分离柱，以电渗流驱动流动相完成色谱分离过程。,CEC中，固定相的选择主要依据HPLC的理论和经验，常用C18或C8。根据固定相的特性（正相、反相等），缓冲液可以是水溶液或有机溶液。常用乙腈水或甲醇水等为流动相。,毛细管分离条件选择流程,1.尽可能多地了解样品的类型、来源、组成及其性质。2.根据样品性质、来源选择分离模式，若无样品信息可先选CZE。3.根据样品性质确定检测方法。4.确定pH、缓冲试剂浓度。5.优化其它操作参数，如毛细管尺寸、分离电压、温度等。6.确定是否需要使用添加剂和非水溶剂。7.根据分离结果考虑是否换其它分离模式。,

16、第四节 毛细管电泳仪,1.高压电极槽和进样机构 2.填灌清洗机构 3.毛细管 4.检测器 5.铂丝电极 6.低压电极槽 7.恒温系统 8.数据记录处理系统,对CE的要求：,进样机构不存在死体积，能进行精确的进样控制。需有毛细管清洗机构。高压电源至少应能输出200A25kV的功率。检测器尽量安装在接地端，优先考虑柱上紫外检测方式。温控范围宽，以0 为界，越宽越好，上限不应低于50，最好能达到6570，至少能在2040内恒温，恒温精度应小于0.2。,高压电源一般采用（030）kV连续可调的直流高压电源，电压输出精度应高于1%。电极通常由直径0.5mm1mm的铂丝制成。电极槽通常是带螺帽的玻璃瓶或塑

17、料瓶（1ml5ml不等），以便于密封。仪器必须接地，操作过程中必须注意高压的安全保护。,一、高压电源,二、毛细管,1.尺寸 毛细管尺寸的选择与分离模式和样品有关。自由溶液电泳多选用50或75m内径的毛细管，分离的有效长度常控制在40100cm之间。如进行大颗粒如红细胞的分离，则需要内径大于 300m的毛细管。CGE或CEC的有效长度一般控制在20cm左右。2.涂层 一般不需涂层处理。大分子化合物分离时，常常需要惰性管壁，以抑制吸附。做CIEF或CGE时，需要涂层毛细管以抑制电渗。在分离中，有时为了加强电渗或改变其方向，也需要涂层毛细管。,3.清洗毛细管在使用过程可能被污染，从而影响分析的结果。

18、为使测定具有良好的重现性，毛细管在使用时应经常清洗。空管通常用 0.l1mol/L NaOH、水和缓冲液顺序冲洗，各洗510min，或增加有机溶剂如甲醇清洗步骤，以除去管中的脂溶性吸附组分。如果怀疑管内壁吸附有蛋白质或其他有机分子，可用0.l1mol/L的HNO3洗 510min，然后再按常规清洗。两次分析之间，可用运行缓冲液清洗、平衡。,三、进样系统,毛细管通道十分细小，所需样品不过数nl，所以不能采用色谱的进样方式。通过让毛细管与样品溶液直接接触，然后由重力、电场力或其它动力来驱动样品进入管中。进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制。进样系统必须包括动力控制、计时控制、电极槽或毛细

19、管移位控制等机构。进样方式：电动法 压力法 扩散法,电动进样,当把毛细管的进样端插入样品溶液并加上电场时，组分就会因电迁移和电渗作用而进入管内。电动进样的控制参数是电场强度E和进样时间t。电场强度E取值多在160kv/60cm 之间；进样时间通常在110s 之间，有时可达1min或更大。优点：电动进样对毛细管内的填充介质没有特殊限制，属普适性方法，可实现自动化操作。缺点：电动进样对离子组分存在偏向，电迁移速度快的进样多，电迁移速度小的少进甚至不进，这会降低分析的准确性和可靠性。,压力进样,也称流动进样，它要求毛细管中的填充介质具有流动性。当毛细管两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，将

20、样品带入。可用三种方法产生进样动力：正压、负压（管尾抽吸）、重力（虹吸）。采用压缩空气（气体钢瓶）可实现正压进样，并可与毛细管清洗系统共用，多为商品仪器采用。优点：压力进样没有偏向问题，缺点：选择性差，样品及其背景同时被引入 管中，对后续分离可能产生影响。,扩散进样,利用浓度差扩散原理，当将毛细管插入样品溶液时，样品分子因在管口界面存在浓度差而向管内扩散。扩散进样动力属不可控制参数，进样量仅由扩散时间控制。对于利用电动和压力进样的系统，设置电场或压力差为零，即可实现扩散进样。扩散进样时间一般在1060s。扩散进样对管内介质没有任何限制，属普适性进样方法。扩散进样具有双向性，在样品分子进入毛细管

21、的同时，区带中的背景物质也向管外扩散，由此可得到畸变程度较小（和背景差别不大）的初始区带，能抑制背景干扰，提高分辨率。扩散与电迁移速度和方向无关，可抑制进样偏向，提高定性定量的可靠性。,四.检测器,在毛细管电泳中，毛细管柱内径小（通常50m或75m)，区带体积小，仅为nl级，区带迁移速度快，这就对检测器提出了很高的要求。毛细管电泳要求检测方法必须具有很高的灵敏度和很快的相应速度，且不能引起区带扩张。常用柱上检测法,紫外检测,由于紫外检测器价格便宜，通用性好，石英毛细管柱有良好的紫外透过性，易于实现柱上检测；再加上大多数有机化合物包括蛋白质等生物大分子都含有紫外发色团，所以它是目前应用最广的检测

22、器。但是，由于受毛细管内径的限制，检测灵敏度较低。固定波长检测器 可变波长检测器 二极管阵列检测器,毛细管检测窗口的制作,现在所用的毛细管大多为熔融石英毛细管，表面涂有聚酰亚胺涂层，不透明，所以检测窗口的外涂层必须剥离除去，剥离长度23mm。剥离方法：硫酸腐蚀法、灼烧法、刀片刮除。,激光诱导荧光（LIF）,采用激光为激发光（强度高，准直性好，可聚焦成比毛细管更细的光束射入毛细管内部），激发出强的荧光。LIF能减小因毛细管壁的散射所引起的背景噪声。,1.激光器 2.高压电源 3.毛细管 4.单色器 5.光电倍增管 6.记录仪 8.激发光光纤 9.荧光收集光纤,其他检测器,电化学检测器化学发光检测器质谱检测器,谢谢！,