第十一部分高效毛细管电泳分析法教学课件.ppt

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1、19:12:42,第十一章高效毛细管电泳分析法,一、PHCE基本原理basic principles of PHCE二、电渗现象与电渗流electroosmosis and electroosmotic flow三、影响电渗流的因素factors influenced electroosmosis四、淌度mobility五、PHCE中的参数与关系式parameters and relation in HPCE六、影响分离效率的因素factors influenced separation efficiency,第二节高效毛细管电泳理论基础,high performance capillary

2、electrophoresis,HPCE,basic theory of HPCE,19:12:42,一、高效毛细管电泳(HPCE)基本原理 basic principles of PHCE,电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。,电场力：FE=qE 阻 力：F=f故：qE=fq离子所带的有效电荷；E 电场强度；离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数(对于球形离子：f=6；离子的表观液态动力学半径；介质的粘度；),19:12:42,所以，迁移速度：,（球

3、形离子）,物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度：单位电场强度下的平均电泳速度。,19:12:42,二、电渗现象与电渗流 electroosmosis and electroosmotic flow,1.电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。,当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow，简称EOF）。,19:12:42,2.HPCE中的电渗现象与电

4、渗流,石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。,在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。,19:12:42,3.HPCE中电渗流的大小与方向,电渗流的大小用电渗流速度电渗流表示，取决于电渗淌度和电场强度E。即 电渗流=E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即=00真空介电常数；介电常数；毛细管壁的Zeta电势。电渗流=0 E实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 电渗流=Lef/teoLef 毛细管有效长度；teo电渗流标记物（中性物质）的迁

5、移时间。,19:12:42,HPCE中电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性 表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。,19:12:42,4.HPCE中电渗流的流形,电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速

6、度的2倍（引起谱带展宽较大）。,19:12:42,5.HPCE中电渗流的作用,电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流+ef 阳离子运动方向与电渗流一致；-=电渗流-ef 阴离子运动方向与电渗流相反；0=电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。,19:12:42,三、HPCE中影响电渗流的因素 factors influenced electroosm

7、osis,1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,2.毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；,19:12:42,3.电解质溶液性质的影响,（1）溶液pH的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和

8、工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。,19:12:42,19:12:42,4.温度的影响,毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%3%；,19:12:42,5.添加剂的影响,（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。,（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二

9、烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。,19:12:42,四、淌度 mobility,淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。1.绝对淌度(absolute mobility)ab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.有效淌度(effective mobility)ef 实际溶液中的淌度(实验中测定的)。ef=aii ai 溶质i 的解离度；i 溶质i 在解离状态下的绝对淌度3.表观淌度 ap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）

10、：ap=ap E,19:12:42,五、HPCE中的参数与关系式 parameters and relation in HPCE,1.迁移时间（保留时间）HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。,V外加电压；L毛细管总长度；2.分离效率（塔板数）在HPCE中，仅存在纵向扩散，2=2Dt,扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。,19:12:42,3.分离度,影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：,19:12:42,六、影响分离效率的因素区带展宽 factors influenced

11、the efficiencyband broadening,1.纵向扩散的影响 在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：2=2Dt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24D t)1/2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%2%。,19:12:42,3.焦耳热与温度梯度的影响,电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：,m电解质溶液的摩尔电导；I工作电流：cm电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏

12、了塞流，导致区带展宽。改善方法：（1）减小毛细管内径；（2）控制散热；,19:12:42,4.溶质与管壁间的相互作用,存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。,19:12:42,5.其他影响因素,（1）电分散作用对谱带展宽的影响 当溶

13、质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2）“层流”现象对谱带展宽的影响 一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；产生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。,19:12:42,请选择内容,第一节 概述generalization第二节 高效毛细管电泳的理论基础basic theory of HPCE第三节 高效毛细管电泳仪器high performance capillary electrophoresis apparatus第四节 高效毛细管电泳的分离模式separate types of HPCE第五节 应用与进展application and advances of HPCE,结束,