第二节蛋白质的结构.ppt

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1、第二节 蛋白质的结构,一、蛋白质概念,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,蛋白质(protein)是源自希腊字proteios，意思就是primary。,二、蛋白质的生物学重要性,1.蛋白质是生物 体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）控制生长和分化7）参与细胞间

2、信息传递8）生物膜,2.蛋白质具有重要的生物学功能,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,体内的含氮物质以蛋白质为主，故测定生物样品中的含氮量，可根据以下公式推算蛋白质的大致含量：,每克样品中蛋白质的含量=每克样品含氮量（克）6.25（总氮量的测定凯氏定氮法）,1/16%,蛋白质元素组成的特点,蛋白质的分类,根据蛋白质的形状、溶解度和功能分为,纤维状蛋白质：比较简单、有规则的线性结构，呈细棒或纤维状，不溶于水，有单一的、重复的二级结构构成。,胶原蛋白,角蛋白,球状蛋白质：形状近球形或椭圆形，含有几种类型的二级结构，并折叠成具有特定构像的三级结构。,膜蛋白：膜蛋白与细胞的各种膜系统结合存在。疏

3、水氨基酸侧链伸向外部，与膜内的非极性相相互作用。,免疫球蛋白,1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次:primary structure 一级结构：氨基酸序列secondary structure 二级结构：螺旋，折叠tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构：蛋白质多聚体 1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和二硫键的位置。介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立的三维结构实体）这两个层次。,蛋白质的结构层次,2 蛋白质的

4、一级结构,蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目。很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。多肽链的氨基酸顺序。多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经知道约十万个不同蛋白质的一级结构。,1 样品必需纯（97%以上）；2 知道蛋白质的分子量；3 知道蛋白质由几个亚基组成；4 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。5 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,

5、测定蛋白质的一级结构的要求,蛋白质和多肽氨基酸顺序的测定,(1)、测定蛋白质分子中多肽链的数目(2)、肽链的拆开和分离(3)、二硫键的断裂(4)、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比(5)、N端、C端的测定(6)、多肽链断裂(7)、测定每个肽段的氨基酸顺序。(8)、确定肽段在多肽链中的次序。(9)、确定原多肽链中二硫键的位置。,测定步骤,(1)多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,可以通过加入盐酸胍的方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,(2)测

6、定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,(3)二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,(4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；,蛋白质一级结构的测定,多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal)。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要

7、的是N-端氨基酸分析法。,末端氨基酸测定,N末端：1、Sanger法DNFB2、Edman法3、DNS-Cl4、酶降解法,C末端：1、肼解法2、酶降解法3、硼氢化锂法,(5)分析多肽链的N-末端和C-末端。,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,N末端氨基酸测定,二硝基氟苯（DNFB）法,Sanger试剂(DNFB)标记N末端,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰

8、-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。DNS氨基酸直接鉴定,丹磺酰氯法,Edman 降解法,苯乙内酰硫脲衍生物,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个地向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,氨肽酶法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C

9、-端氨基酸分离。,C末端氨基酸测定,肼解法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根具不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键；Y都能水解。,羧肽酶法,N末端和C末端的测序除了用于未知蛋白质的一级结构的研究以外，最常用于基因工程表达产物的末端分析。,测定步骤,(6)多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套

10、或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,蛋白质一级结构的测定,酶解法,化学法(Cyanogen bromide)：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,多肽链的选择性降解,测定步骤,(7)测定每个肽段的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,ABCDE*ABCDE*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE*A,*A+B,*A+B+C+D+E*A,*A+*B,*A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 结论：A B C D E,FDNB,FDNB,完全水解,部分水解,(7)测定每个肽段的氨基酸顺序。Sanger降解法,Edman 降解法,一般测定步骤,(8)确定肽段

11、在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。重叠法 多肽 氨基酸序列,蛋白质一级结构的测定,一般测定步骤,(9)确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质一级结构的测定,一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,二硫键位置的确定,蛋白质一级结构的实例,蛋白质中氨基酸顺序的测定 用几种酶或试剂把蛋白质水解成大小不同的片段，找出重叠部分，确定顺序。例1：有一个九肽，用胰蛋白酶水解得到：（1）Ala-Ala-

12、Trp-Gly-Lys,(2)Thr-Phe-Val-Lys;用糜蛋白酶水解得到:(3)Val-Lys-Ala-Ala-Trp,(4)Thr-Phe,(5)Gly-Lys;确定此九肽的氨基酸顺序。,顺序为：Thr-Phe-Val-Lys-Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,核酸推导法,优点：DNA测序技术成熟；对于经典化学难以分析的大分子蛋白质或生物体含量很低的蛋白质有效。可与经典化学测序护卫补充。,二 蛋白质的二级结构,肽链中的肽平面,多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以碳原子相隔。而C-C键和C-N键是单键，可以自由旋转，其中C-C键旋转的角度称，C-N键旋转的角度称。和这一对两

13、面角决定了相邻两个酰胺平面的相对位置，也就决定了肽链的构象。,主要的化学键：氢键主要形式：,蛋白质的二级结构,-螺旋(-helix)-折叠(-pleated sheet)-转角(-turn)无规卷曲(random coil),蛋白质多肽链像螺旋一样盘曲上升，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，每圈螺旋的高度为0.54nm，每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm，螺旋上升时，每个残基沿轴旋转100。,在同一肽链内相邻的螺圈之间形成氢链。,-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋。,（二）-螺旋-螺旋结构的要点如下：,-螺旋的稳定性主要

14、靠氢键来维持。,除了上面这种典型的-螺旋外，还有一些不典型的-螺旋，所以规定了有关螺旋的写法，用“nS”来表示，n为螺旋上升一圈氨基酸的残基数。S为氢键封闭环内的原子数，典型的-螺旋用3.613表示，非典型的-螺旋有3.010，4.416（螺旋）等。,一些侧链基团虽然不参与螺旋，但他们可影响-螺旋的稳定性,也是pauling等人提出来的,它是与-螺旋完全不同的一种结构。为由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。,（三）-折叠,（三）-折叠,多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。两链间的肽键之间形成氢键，

15、以稳固-折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。,也是pauling等人提出来的,它是与-螺旋完全不同的一种结构。为由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。,两段以上的-折叠结构平行排列，两链间可顺向平行，也可反向平行。,每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行的是0.325nm，反平行的是0.35nm。,-螺旋结构与-折叠结构的比较,（四）-转角和无规卷曲,1.-转角（-turn):-转角是指蛋白质的分子的多肽链经常出现180的回折，在回折角上的结构就称-转角，也称发夹结构，或称U形转折。肽链内形成180回折。含4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与第四

16、个形成氢键。第二个氨基酸残基常为Pro。,-转角,2.无规卷曲(random coil):无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构,但许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里。,（五）蛋白质的超二级结构,超二级结构是1973年Rossmann提出的，它是指二级结构的基本结构单位（-螺旋，-折叠等）相互聚集，形成有规律的二级结构的聚集体。已知的超二级结构主要有，x，-曲折和-折叠筒等。,：是两个-螺旋互相缠绕，形成一个左手超螺旋。,x：是两段平行的-折叠通过一段连接链x连接而形成的结构。如x为-螺旋则为；最常见的为两个聚集体连在一起形成 结构，称Rossmann折叠。,Rossmann折叠,如

17、为-折叠，则为。,如x为无规卷曲，则为c。,-曲折（-meander）：,是三条或三条以上反平行的-折叠通过短链，如-转角相连。,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,（六）结构域,由多肽链上相邻的超二级结构紧密相连，进一步折叠形成一个或多个相对独立的致密三维实体，称为结构域。,最常见的结构域约含100200个氨基酸残基，少至40个左右，多至400个以上。,结构域是球状蛋白质的折叠单位，多肽链折叠的最后一步是结构域的缔合。,对那些较小的蛋白质分子来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说是单结构域的。一般来说，大的蛋白质分子可以由2个或更多个结构域组成。,结构域有时也称功能域，功能域是指

18、有功能的部分。功能域可以是一个结构域，也可以是两个或两个以上的结构域组成。,从动力学的角度耒看，一条长的多肽链先折叠成几个相对独立的区域，再缔合成三级结构要比直接折叠成三级结构更合理。,从功能的角度耒看，酶蛋白的活性中心往往位于结构域之间，因为连接各个结构域的常常是一条松散的肽链，使结构域在空间上摆动比较自由，容易形成适合底物结合的空间。,三、蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构(tertiary structure)是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。三级结构主要靠非共价键来维持。,（一）定义,溶菌酶,肌红蛋白是由一条多肽链折叠盘绕成近似球状的构象

19、。,(2)主链的80%左右是右手螺旋，其余为无规卷曲，一条多肽链 共有8个螺旋区（A、B、C、D、E、F、G、H），7个非螺 旋区（二个在末端，中间有五个）。,(3)氨基酸残基的亲水基团几乎全部分布在分子的表面，而疏 水基团几乎全部在分子的内部。,(4)血红素辅基垂直地伸出分子表面，通过一个His残基和分子 内部相连。,球蛋白三级结构的特征球状蛋白质的三维结构有明显的折叠层次二级结构-超二级结构-三级结构,从目前对球状蛋白质二、三级结构研究的资料来看，它们有一些共同的特点：,(1)在球状蛋白质分子中,一条多肽链往往通过一部分-螺旋，一部分-折叠，一部分-转角和无规卷曲等使肽链折叠 盘绕成近似球

20、状的构象。,(3)球状蛋白质的表面往往有内陷的空穴，空穴周围有许多疏 水侧链，是疏水区，这空穴往往是酶的活性部位或蛋白质 的功能部位。,球状蛋白质含有多种二级结构原件,(2)球状蛋白质的大多数极性侧链总是暴露在分子表面形成亲水面，而大多数非极性侧链总是埋在分子内部形成疏水核。,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,四、蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构(quaternary structure)。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。,单体蛋白质:

21、仅含有一条肽链寡聚蛋白质或多聚蛋白质：两条或者两条以上的肽链。每条肽链单体称为亚基或亚单位，亚基之间通过共价键缔合。多聚蛋白质可以是由单一类型的亚基组成，称为同多聚蛋白质。由几种不同类型的亚基组成，称为咋多聚蛋白质。,一般来说亚基不具有生物活性，即使有也很小，只有当这些亚基聚合成一个完整的蛋白质分子后，才具有生物活性。,亚基间的作用力,维持蛋白质四级结构的主要化学键是疏水键，由亚基间氨基酸残基的疏水键相互作用而形成的。二亚基缔合过程有效埋藏原来暴露于溶剂中表面积，形成有利于稳定结构的疏水作用。氢键、范德华力、二硫键等也起一定作用。,相同亚基的异种缔合相互作用的表面是不同的。异种缔合是开放末端的

22、结构。许多蛋白质借异种缔合可以几乎无限聚合，形成线性或者螺旋形的大聚合体。,相同亚基间的缔合：同种缔合和异种缔合不同亚基间的缔合,同种缔合相互作用的表面是相同的，形成的结构式一个封闭的二聚体。,维持蛋白质构象的化学键,疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。,氢键：羰基氧与酰胺氢之间形成的氢键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力。侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链、主链肽基与水,大多数蛋白质采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键，与此同时，保持大多数能形成氢键的侧链处于蛋白质分子的表面与水相互作用。,范德华力包括引力和斥力两种相互作用。范德华力只有当两个非键合原子处于一定距离时才能达到最大。疏水作用两个非极性基团为避开水相而群集在一起的作用力。对于稳定蛋白质三维结构有重要作用。不是疏水基团之间有什么吸引作用，而是疏水基团或疏水侧链出于避开水的需要而被迫接近。,离子键正电荷与负电荷之间的静电相互作用。大多数情况下，带电基团都分布在球状蛋白质分子表面，与介质水发生电荷-偶极之间的相互作用，形成排列有序的水化层。配位键两个原子由单方面提供共用电子对形成化学键。蛋白质与金属离子结构中常含有配位键。二硫键在二硫键形成之前，蛋白质分子已经采取了它特有的三维结构。二硫键的形成不规定多肽链的折叠。蛋白质形成的二硫键能够稳定三维结构的存在。,