E玫瑰花环形成实验.ppt

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1、E玫瑰花环形成实验,中山医学院免疫教研室2012-04,E Rosette Forming Cell Test,掌握E花环形成的原理 熟悉E花环形成实验的步骤及光镜下E 花环的形态 熟悉磁珠分离的原理,实验目的,T细胞的表面分子是T细胞与其它细胞和分子间相互识别及作用的物质基础。它们在T细胞活化、增殖和分化等过程中起重要作用。TCR-CD3复合物参与T细胞的抗原识别和信号转导；CD2、CD28、CTLA-4、CD45、CD40L 等膜蛋白参与T细胞活化及T细胞与其它细胞间相互作用。CD4/CD8分子辅助TCR识别结合抗原，参与信号转导；根据CD4和CD8分子的表达将其分为CD4+T和CD8+T

2、细胞。,T细胞表面分子,依靠表面标记的分离方法,流式细胞术分离法：利用各种荧光素标记的表面标记特异性抗体，使不同表面标记的细胞结合上不同的荧光素，借助荧光活化细胞分选仪将各种细胞分离开来。,*,*免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这种表面标记的细胞分离出来。,磁珠(microbead),标记细胞上的磁珠在扫描电镜下也几乎看不到,磁珠分离策略：,一.阳性分选,磁珠标记目的细胞,未标记细胞先行流出,移出磁场后收集目的细胞,CD4+T细胞,分离柱,CD4-T细胞,磁珠标记非目的细胞,目的细胞先

3、行流出,二.阴性分选,成熟的人T细胞表面表达绵羊红细胞（SRBC）受体（即CD2分子），能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，可在光学显微镜下观察计数。本法可用于分离外周血T细胞及检测T细胞的数量和比例。,E花环分离法原理,*,实验材料,1.肝素抗凝血2.Hanks液3.淋巴细胞分离液4.绵羊红细胞悬液5.灭活小牛血清6.水平离心机、37温箱、显微镜等,实验方案,取外周血,绵羊红细胞,淋巴细胞,分离,显微镜下观察,+,实验步骤,用Hanks液配成106细胞/0.1ml,加等量灭活小牛血清(0.1ml),取0.1ml,加入0.5绵羊红细胞0.2ml,混匀，37温箱放置5分钟,1000rpm离心5m

4、in,加1小滴1美蓝，用毛细吸管轻轻混匀,取1滴于玻片上，加上盖玻片,高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞,置4冰箱,5min,30-45min,结果判断,凡能结合三个以上绵羊红细胞者为玫瑰花形成阳性细胞。正常人的花环形成率50-70%，大致可以代表周围血中T细胞的百分数。,左:（甲紫染色，800）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞；右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。,T淋巴细胞玫瑰花环,T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，6500,测定外周血中的T细胞数，观察受检者的细胞免疫功能及免疫增强剂的疗效。观察免疫抑制剂的效果，协助进行恶性肿瘤疗效的观察及预后判断等。,临床应用,注意事项,1.实验血液新鲜分离:是为了保证淋巴细胞 的活性,不影响E玫瑰花环形成率。2.绵羊红细胞要新鲜,采用无菌脱纤维羊血。,Thanks!,