第十一章遗传的分子基础.ppt

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1、湖北大学生命科学学院 陈建国,1,第十一章 遗传的分子基础,第一节 DNA作为主要遗传物质的证据第二节 核酸的化学结构与DNA复制*第三节 遗传信息的表达与调控第四节 基因的概念与发展第五节 基因突变的分子机制第六节 遗传工程,湖北大学生命科学学院 陈建国,2,第一节 DNA作为主要遗传物质的证据,一、DNA是遗传物质的间接证据二、DNA是遗传物质的直接证据(一)、细菌转化试验(二)、噬菌体侵染与繁殖试验(三)、烟草花叶病毒拆合实验*三、非核酸类的遗传物质,湖北大学生命科学学院 陈建国,3,一、DNA是遗传物质的间接证据,1.DNA含量的恒定性；2.DNA代谢的稳定性；3.基因突变与紫外线诱变

2、波长的关系。,4,湖北大学生命科学学院 陈建国,(二)、噬菌体侵染与繁殖试验,1.背景知识噬菌体侵染与繁殖基本过程：T2噬菌体浸染大肠杆菌后，遗传物质进入细菌细胞；利用大肠杆菌的遗传复制系统复制噬菌体遗传物质；利用大肠杆菌的遗传信息表达系统合成噬菌体组件；最后组装形成完整的T2噬菌体。因此只要弄清侵染时进入细菌的是噬菌体的哪一部分，就可能证明哪种物质是遗传信息的载体。另外：P是DNA的组成部分，但不存在于蛋白质中；S存在于蛋白质中，但DNA中没有。,5,湖北大学生命科学学院 陈建国,2.Hershey和Chase的实验,6,湖北大学生命科学学院 陈建国,结果与结论,试验结果表明：主要是由于DN

3、A进入细胞内才产生完整的噬菌体；结论：DNA才是(噬菌体的)遗传物质。题外话：与Avery等人研究比较，本试验的精度低得多。但是由于放射性标记法(也称为示踪原子法)，当时为人们普遍采用；同时由于核酸研究及其它相关的成果，本试验结果很快得到人们的广泛认同。,7,湖北大学生命科学学院 陈建国,(三)、烟草花叶病毒拆合试验,烟草花叶病毒(TMV)是由RNA与蛋白质构成的管状微粒：中心是单链螺旋RNA、外部是蛋白质外壳。1.拆分感染试验：将TMV的RNA与蛋白质分离、提纯；分别接种烟叶，发现RNA能使烟叶致病，而蛋白质不能；用RNA酶处理RNA后接种烟叶也不能致病，表明RNA可能就是TMV的遗传物质。

4、,8,湖北大学生命科学学院 陈建国,2.重组合试验,Frankel-Conrat,Singer(1956)进行了图示试验：综上所述：到上世纪中期，多方面证据都直接或间接地表明DNA是主要的遗传物质，而在缺乏DNA的某些病毒中RNA就是遗传物质。,湖北大学生命科学学院 陈建国,9,第二节 核酸的化学结构与DNA复制,*一、早期对核酸化学性质的研究二、DNA的一级结构三、DNA的二级结构*四、RNA的分子结构*五、DNA的复制,10,湖北大学生命科学学院 陈建国,*一、早期对核酸化学性质的研究,虽然上世纪中才认识到DNA的生物学功能，核酸研究却已有一百多年历史：F.Mischer(1869)从外科

5、绷带上脓细胞核中分离出一种不同于蛋白质的物质，含磷量高、并具有很强的酸性。他将这种物质称核质(素)(nuclein)；A.Kossel(1879)发现酵母等核质具有A、G、T、C四种碱基；R.Altamm(1889)将核素命名为核酸(nucleic acid)。,Kossel(1901)又发现核酸中具有碳水化合物(糖)；P.A.T.Levene(1909)研究表明：酵母核酸含有五碳糖核糖；Fisher(1914)人工合成核苷酸；P.A.T.Levene(1929)又发现动物胸腺细胞核酸含有脱氧核糖.Levene将前者命名为核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)，后者命名为脱氧核糖核

6、酸(deoxy-ribonucleicacid,DNA)。并指出动、植物中均存在这两种核酸。,11,湖北大学生命科学学院 陈建国,二、核酸的一级结构,关于碱基的种类、分子式、核苷酸的种类、结构等内容是生物化学中讨论的内容，请课后复习。在此谈三个关于核酸一级结构的内容：(一)、“四核苷酸”假说；(二)、查伽夫定则及其意义；*(三)、核苷酸序列及其测定。,12,湖北大学生命科学学院 陈建国,(一)、“四核苷酸”假说,P.A.T.Levene(1930)提出“四核苷酸”假说，认为：核苷酸是核酸的基本组成单位；核酸是“磷酸核糖(碱基)磷酸”的核苷多聚体。四核苷酸假说奠定了核酸化学基础。但同时认为：核酸

7、多聚体是由“四核苷酸结构”重复形成；每个四核苷酸结构包含四种碱基各一个；所以事实上认为在任何DNA中，四种碱基是等量的，DNA是四核苷酸结构的简单重复。这种观念影响了人们对核酸生物学功能的进一步认识。,13,湖北大学生命科学学院 陈建国,(二)、查伽夫定则及其意义,E.Chargaff于1946-1950年根据纸层析、离子交换层析和紫外分光光度试验结果提出查伽夫定则：四种碱基的数量不是等量的；同一物种DNA碱基组成不变，而物种间则有很大不同；嘌呤碱基总量与嘧啶碱基的总量(克分子总量)相等(A+G=T+C)，且A=T、G=C。,14,湖北大学生命科学学院 陈建国,*(三)、核苷酸序列及其测定,查

8、伽夫定则表明：核酸并不是四核苷酸结构的简单重复，核酸的碱基序列信息可能具有重要意义。以后的研究表明：碱基序列正是核酸生物学功能的基础，是遗传信息的内在形式。DNA及RNA分子序列分析技术也是最重要的分子遗传学研究技术：Sanger双脱氧法；Maxam&Gillbert化学法；基于化学法的DNA序列自动分析仪已成为常规实验设备。,湖北大学生命科学学院 陈建国,15,三、DNA的二级结构,*(一)、DNA分子结构的研究1.鲍林研究小组2.威尔金斯、富兰克林研究小组3.沃生、克里克研究小组(二)、DNA分子双螺旋结构模型1.DNA分子双螺旋结构模型要点2.DNA双螺旋结构模型的意义3.DNA分子构型

9、的多态性,16,湖北大学生命科学学院 陈建国,*(一)、DNA分子结构的研究,在“四核苷酸结构”理论的误导下，人们普遍认为核酸的组成、结构简单，可能不具有重要功能，一度忽略了对核酸的研究。上世纪中期，众多研究表明：核酸是遗传信息的载体，显然DNA的结构研究是进一步研究其功能和作用方式的基础。也由此激发了科学家从事核酸结构研究的兴趣，当时进行DNA结构研究的科学家很多，最重要有：,17,湖北大学生命科学学院 陈建国,1.鲍林研究小组,主要工作：鲍林(Pauling)等1951年(提出蛋白质-螺旋模型后)开始研究DNA分子结构。根据阿斯伯利Astbury等1938年获得的DNA分子晶体X射线衍射图

10、像(显示DNA分子晶体呈螺旋结构)进行研究。提出DNA分子三链螺旋结构模型：引入多链、螺旋和氢链等概念。评价：虽然他们提出的模型并不正确，但是其研究方向和所采用的方法却为DNA分子结构模型研究确立了方向。注：1954年鲍林因研究物质聚合力而获得诺贝尔化学奖。,18,湖北大学生命科学学院 陈建国,2.威尔金斯、富兰克林研究小组,主要工作成就：Wilkins和Franklin改进了DNA分子晶体X射线衍射图谱技术；于1951年获得了更为清晰的图像；结果表明：碱基位于螺旋内侧而磷酸基团在外侧，同时测得了DNA螺旋的直径和螺距。,19,湖北大学生命科学学院 陈建国,3.沃生、克里克研究小组,Wasto

11、n、Crick(1951-1953)：研究手段非常简单：用纸板等做磷酸、核糖和碱基模型，拼凑DNA分子的三维结构。理论知识深厚、富于创造性；视野广阔、收集信息全面并善于分析利用。,20,湖北大学生命科学学院 陈建国,3.沃生、克里克研究小组,主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三个方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他们的第三个DNA双螺旋结构模型。现在人们公认这是分子遗传学建立的标志。为此Waston，Crick和Wilkins于1962年获得了诺贝尔生理学及医学奖。,21,湖北大学生命科学学院 陈建国,1.DNA分子双螺旋结构模型要点,瓦特森(Wat

12、son,J.D.)和克里克(Crick,F.)模型最主要特点有：(1)两条多核苷酸链以右手螺旋的形式，彼此以一定的空间距离，平行地环绕于同一轴上，很象一个扭曲起来的梯子(图)。,22,湖北大学生命科学学院 陈建国,23,湖北大学生命科学学院 陈建国,1.DNA分子双螺旋结构模型要点,(2)两条多核苷酸链走向为反向平行。即一条链磷酸二脂键为53方向，而另一条为35方向，二者刚好相反。亦即一条链对另一条链是颠倒过来的，这称为反向平行。,24,湖北大学生命科学学院 陈建国,1.DNA分子双螺旋结构模型要点,(3)每条长链的内侧是扁平的盘状碱基，碱基一方面与脱氧核糖相联系，另一方面通过氢键(hydro

13、gen bond)与它互补的碱基相联系，相互层叠宛如一级一级的梯子横档。互补碱基对A与T之间形成两对氢键，而C与G之间形成三对氢键,25,湖北大学生命科学学院 陈建国,1.DNA分子双螺旋结构模型要点,(4)上下碱基对之间的距离为3.4。每个螺旋为34(3.4nm)长，刚好含有10个碱基对，其直径约为20。(5)在双螺旋分子的表面大沟(major groove)和小沟(minor groove)交替出现。,26,湖北大学生命科学学院 陈建国,DNA的双螺旋结构,27,湖北大学生命科学学院 陈建国,DNA的双螺旋结构,28,湖北大学生命科学学院 陈建国,碱基配对及氢键形成,29,湖北大学生命科学

14、学院 陈建国,2.DNA双螺旋结构模型的意义,DNA双螺旋模型结构同时表明：DNA复制的明显方式半保留复制。Waston和Crick在1953年就指出：DNA可以按碱基互补配对原则进行半保留复制。而在此之前对复制方式人们对一无所知。基因和多肽成线性对应的一个可能的理由：DNA核苷酸顺序规定该基因编码蛋白质的氨基酸顺序；DNA中的遗传信息就是碱基序列；并存在某种遗传密码(genetic code)，将核苷酸序列译成蛋白质氨基酸顺序。在其后的几十年中，科学家们沿着这两条途径前进，探明了DNA复制、遗传信息表达与中心法则等内容。,30,湖北大学生命科学学院 陈建国,3.DNA分子构型的多态性,近来发

15、现DNA的构型并不是固定不变的，除主要以瓦特森和克里克提出的右手双螺旋构型存在外，还有许多变型。所以现在一般将瓦特森和克里克提出的双螺旋构型称为BDNA。BDNA是DNA在生理状态下的构型。生活细胞中极大多数DNA以BDNA形式存在。但当外界环境条件发生变化时，DNA的构型也会发生变化。实际上在生活细胞内，BDNA一螺圈也并不是正好10个核苷酸对，而平均一般为10.4对。,31,湖北大学生命科学学院 陈建国,3.DNA分子构型的多态性,当DNA在高盐浓度下时，则以ADNA形式存在(图)。ADNA是DNA的脱水构型，它也是右手螺旋，但每螺圈含有11个核苷酸对。ADNA比较短和密，其平均直径为23

16、。大沟深而窄，小沟宽而浅。在活体内DNA并不以A构型存在，但细胞内DNARNA或RNARNA双螺旋结构，却与ADNA非常相似。,32,湖北大学生命科学学院 陈建国,3.DNA分子构型的多态性,现在还发现，某些DNA序列可以以左手螺旋的形式存在，称为ZDNA(图)。当某些DNA序列富含GC，并且在嘌呤和嘧啶交替出现时，可形成ZDNA。ZDNA除左手螺旋外，其每个螺圈含有12个碱基对。分子直径为18，并只有一个深沟。现在还不知道，ZDNA在体内是否存在。,33,湖北大学生命科学学院 陈建国,3.DNA分子构型的多态性,34,湖北大学生命科学学院 陈建国,*四、RNA的分子结构,至于RNA的分子结构

17、，就其化学组成上看，也是由四种核苷酸组成的多聚体。它与DNA的不同，首先在于以U代替了T，其次是用核糖代替了脱氧核糖，此外，还有一个重要的不同点，就是绝大部分RNA以单链形式存在，但可以折叠起来形成若干双链区域。在这些区域内，凡互补的碱基对间可以形成氢键(图)。但有一些以RNA为遗传物质的动物病毒含有双链RNA。,35,湖北大学生命科学学院 陈建国,RNA的分子结构,湖北大学生命科学学院 陈建国,36,*第三节 遗传信息的表达与调控,一、中心法则及其发展二、遗传信息的转录(RNA的合成)与RNA的加工三、遗传密码及其特性四、遗传信息的翻译五、基因表达调控,37,湖北大学生命科学学院 陈建国,一

18、、中心法则及其发展,遗传信息从DNAmRNA蛋白质的转录和翻译的过程，以及遗传信息从DNADNA的复制过程，这就是分子生物学的中心法则(central dogma)中心法则(central dogma)阐述生物世代、个体以及从遗传物质到性状的遗传信息流向，即遗传信息在遗传物质复制、性状表现过程中的信息流向。最初由Crick提出，并经过了多次修正。,38,湖北大学生命科学学院 陈建国,一、中心法则及其发展,中心法则所阐述的是基因的两个基本属性：复制与表达。关于这两个属性的分子水平的分析，对深入理解遗传及变异的实质具有重要的意义。这一法则被认为是从噬菌体到真核生物的整个生物界共同遵循的规律。近年来

19、的研究发现RNA可以反转录成为DNA，RNA还可以自我复制以及在离体条件下DNA可以直接指导蛋白质的合成，从而增加了原中心法则的信息流向，丰富了中心法则的内容。,39,湖北大学生命科学学院 陈建国,一、中心法则及其发展,40,湖北大学生命科学学院 陈建国,中心法则的发展,反转录(逆转录)：反转录酶；cDNA。RNA的自我复制。DNA指导蛋白质合成。,41,湖北大学生命科学学院 陈建国,三、遗传密码及其特性,遗传密码的基本特性：三联性；非重叠性；连续性；简并性；有序性；通用性。,42,湖北大学生命科学学院 陈建国,三、遗传密码及其特性,起始密码子与终止密码子：起始密码子：AUG(甲硫氨酸/甲酰甲

20、硫氨酸)；终止密码子(无义密码子)：UAA、UAG、UGA。通用性的另外情况：,湖北大学生命科学学院 陈建国,43,第四节 基因的概念与发展,一、经典遗传学中基因的概念二、生化遗传和早期分子遗传学对基因概念的发展三、基因的微细结构与性质四、现代分子遗传学关于基因的概念,44,湖北大学生命科学学院 陈建国,二、生化遗传学对基因概念的发展,生化遗传及早期分子遗传研究在两个重要方面发展了基因的概念：基因是DNA分子上带有遗传信息的特定核苷酸序列区段，并且在染色体上位置固定、序列连续；遗传信息就存在于核苷酸(碱基)序列中。“一个基因一个酶”，基因表达为蛋白质；基因的核苷酸序列决定蛋白质氨基酸序列。,湖

21、北大学生命科学学院 陈建国,45,三、基因的微细结构与性质,(一)、位置效应(二)、遗传的最小结构单位果蝇眼型遗传与拟等位基因双重感染与基因内重组遗传的最小结构单位(三)、遗传的最小功能单位,46,湖北大学生命科学学院 陈建国,(一)、位置效应,位置效应：基因在染色体上位置不同对性状表现的作用(程度)也可能不同。果蝇16A区段(Bar基因)重复处于染色体的不同位置对其个体眼面大小(小眼数目)的效应不同。位置效应表明：染色体并非基因的简单容纳器，基因在染色体上的位置也对其功能具有重要影响。所以“念珠理论”的第一点(基因与染色体的关系)得到了发展。“念珠理论”的另一个内容是基因的结构不可分性(最小

22、遗传结构单位)。不可分性最早遇到的挫折也是来自对果蝇的研究。,47,湖北大学生命科学学院 陈建国,1.果蝇眼型遗传试验(E.B.Lewis),列维斯得到果蝇染色体2末端一个位点的两个突变型：显性星眼突变型(S)：杂合体S/+野生型眼稍小；隐性拟星眼(ast)：纯合体ast/ast眼更小。基因定位发现两个突变在同一区域，且S/ast杂合体眼型最小。几种基因型眼型表现为：+/+S/+ast/ast S/ast；将四种表现型分别用：A、B、C、D表示。功能和位置关系表明S和ast是等位基因。Lewis得到一个果蝇品系：S基因两侧具有al和ho两个隐性突变标记(al S ho)，并获得杂种al S h

23、o/+ast+。,48,湖北大学生命科学学院 陈建国,试验结果,49,湖北大学生命科学学院 陈建国,结果分析与拟等位基因(Psendoallele),野生型的个体是如何产生的？研究发现回复突变频率很低，不能产生如此高频率(万分之2.8)的野生型；进一步分析发现：16个野生型个体均表现为+ho，表明在al-ho间发生了交换。基于基因不可分性(交换只发生在基因间)，Lewis认为：S和ast是两个紧密连锁基因，而不是一对等位基因；由于它们功能相似，均控制果蝇的眼型，所以称为拟等位基因(Psendoallele)。据此Lewis认为野生型产生于拟等位基因S和ast间交换。,50,湖北大学生命科学学院

24、 陈建国,图示与分析,Lewis认为突变基因S与拟星眼突变基因ast间是拟等位基因关系，能解释果蝇眼型遗传试验结果；同时也能解释其它研究结果，如：果蝇菱形眼突变型遗传。但拟等位基因并不能直接证明，因为即使S与ast确是拟等位基因，也难以分离它们：表型相似、紧密连锁。,51,湖北大学生命科学学院 陈建国,2.T4突变型(rII)遗传研究,Seymour Benzer(1955)用E.Coli烈性噬菌体T4突变型遗传研究证明：拟等位基因的说法是不正确的。T4野生型在E.Coli菌苔上产生小而不规则噬菌斑。T4突变品系按表型可分为：rI、rII、rIII三类。其中rII在E.Coli B上产生快速溶

25、菌现象，形成大而圆噬菌斑，在E.Coli K()上不能生长。,52,湖北大学生命科学学院 陈建国,试验方法与结果,试验方法：最初得到8个不同的r突变型品系，8个突变基因均定位于T4DNA的一个区段内(rII区段)；将8种突变型两两组合混和感染E.Coli B菌株(双重感染,double infection)；从混和培养物中提取噬菌体颗粒感染E.coli K()。试验结果：在菌苔上获得了许多小而粗糙的野生型噬菌斑。,53,湖北大学生命科学学院 陈建国,双重感染试验,54,湖北大学生命科学学院 陈建国,野生型的产生与基因内重组,结果分析：回复突变的频率很小，不会产生如此高频率的野生型噬菌体(斑)；

26、所以野生型只能由重组产生。用拟等位基因可以解释试验结果；但同时意味着：rII区段内至少存在8个拟等位基因。Benzer先后分离到400多个不同的rII突变。在rII区段内存在如此多的基因显然是不可能的。结论：这些基因并不是所谓的拟等位基因，而就是rII区段突变形成的复等位基因。基因是由更小的重组单位构成，野生型产生于基因内重组，从而推翻了经典遗传学基因不可分性的性质。,55,湖北大学生命科学学院 陈建国,*双重感染法绘制rII区段连锁图,操作方法：用两种rII突变型双重感染B品系，收集溶菌液；分别接种到B品系、K()品系菌苔上；考察两个品系菌苔上的噬菌斑数目，就可以计算两个突变位点间的重组值；

27、绘制连锁遗传图。由于采用了条件致死选择系统(即在E.Coli K()上rII不能生长)，分辨率极高，可以检测到十万分之一的重组值。,56,湖北大学生命科学学院 陈建国,B品系双重感染的结果,57,湖北大学生命科学学院 陈建国,3.最小的结构单位,重组值检测精度可达十万分之一，但实际结果不会低于0.01%；可推断基因内存在最小重组单位，本泽尔将最小重组单位定义为重组子(recon)。rII区段存在多种突变的结构表明：基因也并非最小突变单位。Benzer提出用突变子(muton)来描述基因突变的最小单位。理论上讲突变子不必等于重组子。但以后研究显示：突变子和重组子都是一个核苷酸对或者碱基对(bp)

28、。所以基因内每个碱基均可能发生突变，任意两个碱基间均能发生交换重组。,58,湖北大学生命科学学院 陈建国,1.双突变杂合体的互补作用,假定有两个独立起源的隐性突变，具有类似的表型，如何判定是属于同一基因(功能单位)的突变还是分别属于两个基因(功能单位)的突变呢？在二倍体生物中，可以建立双突变杂合体。双突变体杂合体有两种形式，即顺式(cis)和反式(trans)，如图所示：,59,湖北大学生命科学学院 陈建国,顺反测验与顺反子,根据两突变反式双杂合体有无互补作用可以判断它们是否为同一个功能单位的突变：突变型无互补作用为同一功能单位的突变；野生型有互补作用为不同功能单位的突变。这种测验称为互补测验

29、，也称为顺反测验(cis-trans test)。Benzer将顺反测验所确定的最小遗传功能单位称为顺反子(cistron)，顺反子内发生的突变间不能互补。,60,湖北大学生命科学学院 陈建国,rII顺反测验,rII区段突变的性质：rII突变具有共同性状，按经典遗传学理论，rII区段为一个基因；如果基因是最小的功能单位，它也是一个顺反子。Benzer通过顺反测验表明：100多个rII突变型可以分为A、B两组，组间突变型间能够互补，而组内的突变型间不能互补；与rII区段连锁图对照发现：两组突变分别位于rII区段的两端|A|B|。,61,湖北大学生命科学学院 陈建国,rII的两个顺反子,经典遗传学

30、意义上的一个基因(rII区段)实际上有两个顺反子(功能单位)。因此基因也很可能不是遗传的最小功能单位。有些基因具有一个顺反子，有些基因具有多个顺反子。在多顺反子情况下，基因是几个功能单位的复合体。Benzer提出“一个顺反子一条多肽链”。,62,湖北大学生命科学学院 陈建国,四、现代分子遗传学关于基因的概念,(一)、现代基因概念基因是DNA分子上带有遗传信息的特定核苷酸序列区段。基因由重组子、突变子序列构成的。重组子是DNA重组的最小可交换单位；突变子是产生突变的最小单位；重组子和突变子都是一个核苷酸对或碱基对(bp)。基因可以包含多个功能单位(顺反子)。,63,湖北大学生命科学学院 陈建国,

31、(二)、基因的功能类型,根据基因的原初功能可以将基因分为：1.编码蛋白质的基因，即有翻译产物的基因。如结构蛋白、酶等结构基因和产生调节蛋白的调节基因。2.没有翻译产物，不产生蛋白质的基因。转录产物RNA不翻译，如编码tRNA、rRNA。3.不转录的DNA区段。如启动基因、操纵基因。启动基因是转录时RNA多聚酶与DNA结合的部位。操纵基因是阻遏蛋白、激活蛋白与DNA结合的部位。,64,湖北大学生命科学学院 陈建国,(三)、基因的几种特殊形式,1.重复基因：指在染色体组上存在多份拷贝的基因。重复基因往往是生命活动中最基本、最重要的功能相关的基因。最典型的重复基因是rRNA、tRNA和组蛋白基因等。

32、2.重叠基因：同一段DNA序列，由于阅读框架(转录范围)不同，同时成为两个或两个以上基因的组成部分。因此基因在染色体上可能有重叠，甚至一个基因完全存在于另一个基因内部。,65,湖北大学生命科学学院 陈建国,3.断裂基因或隔裂基因,生物遗传和早期分子遗传认为基因是一个连续的、完整的结构。1977年Doel研究表明：卵清蛋白基因中间存在不表达的碱基序列，表明基因的DNA序列可能是不连续的。外显子：参加蛋白质编码的DNA片段；内含子：不参加蛋白质编码的DNA片段。真核生物基因可能是不同外显子的组合断裂基因。,66,湖北大学生命科学学院 陈建国,4.跳跃基因(jumping gene),又称为转座子(

33、transposon)、转座因子、转位因子(transposable element)。生化遗传和早期分子遗传学还认为基因在染色体上的相对位置是固定的。后来发现某些DNA序列可以在染色体上转变位置。转座子转位的过程也是一个遗传重组过程；转座子在染色体上转位可能会引起插入位置基因功能丧失(突变)，再次转位离开插入点时便会发生基因功能的恢复。,湖北大学生命科学学院 陈建国,67,第五节 基因突变的分子机制,一、locus与site二、基因突变的类型三、DNA的防护机制四、DNA修复与突变的产生五、化学因素诱变的分子机制,68,湖北大学生命科学学院 陈建国,一、locus与site,经典遗传学认为：

34、基因是染色体上的一个点，称位点(site)。现代基因概念认为：基因是DNA分子带有遗传信息的碱基序列区段；基因是由众多碱基对构成，此时将一个碱基对称为基因的一个位点(site)；而将基因在染色体上的位置则称为座位(locus)。,69,湖北大学生命科学学院 陈建国,二、基因突变的类型,1.根据突变所引起的表型改变分为：形态突变型；生化突变型；致死突变型；条件致死突变型。2.根据基因结构的改变方式：碱基替换突变；碱基倒位；移码(插入与缺失)突变。,70,湖北大学生命科学学院 陈建国,二、基因突变的类型,3.从DNA碱基序列改变的多少：单点突变(替换)；与经典遗传学的点突变point mutati

35、on比较.多点突变(移码)。4.从突变所引起的遗传信息意义的改变：同义突变；错义突变；无义突变。,湖北大学生命科学学院 陈建国,71,第六节 遗传工程,一、遗传工程概述*二、染色体工程*三、细胞工程四、基因工程,72,湖北大学生命科学学院 陈建国,一、遗传工程概述,遗传研究要阐明遗传与变异的现象和基本规律，探索遗传与变异的原因及其物质基础。在此基础上：解释、研究生物进化的原因、过程和规律(遗传与进化)。改善动、植物和微生物的遗传特性按照人类的意愿，创造、培育各种生物的新类型、新品种的人工进化过程(育种学)。育种工作的理论和技术水平在很大程度上取决于遗传学所取得的成就。讫今为止，动、植物育种的绝

36、大部分成就都是以经典遗传、细胞遗传和数量遗传理论为基础所取得的。六、七十年代的绿色革命；育种工作面临的问题。,73,湖北大学生命科学学院 陈建国,一、遗传工程概述,(一)、遗传工程的基础人类对自然改造的能力取决于对自然规律的认识水平。分子遗传、生物化学及分子生物学、细胞生物学的理论和技术发展使生物遗传操作的能力正在不断提高。遗传工程的理论与技术基础主要来自于：1.分子遗传学的理论；2.生物化学及分子生物学的成就；3.细胞生物学理论和技术。,74,湖北大学生命科学学院 陈建国,(二)、遗传工程的含义,生物技术生物工程：遗传工程；蛋白质工程、酶工程；微生物工程；遗传工程：在分子遗传理论、技术的基础

37、上，通过工程设计与施工方式，从细胞、分子水平改造生物遗传特性。,作为一个综合性的技术群体系，广义的遗传工程包含许多相关的组成部分，其主要的部分有三个：1.染色体工程；2.细胞工程；3.基因工程。狭义的遗传工程指的是基因工程。,75,湖北大学生命科学学院 陈建国,*二、染色体工程,染色体工程是物种间遗传转移的最传统的方式，也是目前广泛进入生产应用的遗传工程。其重要性因作物不同而异：对蕃茄而言，世界上任何具有商业价值的栽培品种都带有一个从野生种导入的抗枯萎病性状，其它六个野生种则是耐盐性、抗虫性等性状的来源。小麦许多抗白粉病基因和抗锈病基因都来源于其野生近缘物种。相反，蚕虫改良则完全是在栽培种(V

38、icia faba)内进行杂交选择。现在还不能从其它任何种导入基因到该作物中。,76,湖北大学生命科学学院 陈建国,(一)、种间有性杂交,生殖隔离是物种形成的原因之一，也是染色体工程面临的第一个难题，获得种间有性杂种的难易直接影响外源基因导入栽培作物。对不同的作物而言，种间杂交障碍的机制可能截然不同，其表现阶段也各不相同。目前认为，种间杂交产生杂种的障碍可能表现在以下几个阶段：受精前柱头和花柱中的障碍；受精过程中的障碍；受精后胚与种子发育过程中的障碍。,77,湖北大学生命科学学院 陈建国,受精前障碍与克服,障碍机制：物种间花粉管与雌蕊不亲和，在花粉管到达胚珠之前，停止伸长而不能受精。主要克服办

39、法：主要是选择适当的授粉时期，采用正反杂交、蒙导授粉、植物生长调节剂等。另外，有明确试验证据表明，栽培物种和野生种内均存在可杂交性遗传变异，并受简单遗传控制。利用可杂交性基因，能提高种间杂交的效率。,78,湖北大学生命科学学院 陈建国,受精过程的障碍与克服,被子植物受精过程属于双受精，对种间杂交受精过程的生殖生物学研究表明：种间杂交的失败往往是由于双受精之一失败引起的。讫今为止，人们对受精的控制机制知之甚少，所以这一领域明显是一个有风险，但又极可能富有成效的研究领域。,79,湖北大学生命科学学院 陈建国,受精后发育障碍与克服,受精过程的障碍机制：受精胚珠发育过程中也经常由于胚、胚乳和母本组织发

40、育异常或发育不平衡而最终不能产生种间杂种种子。克服方法：常用技术是从生理角度进行调节，如：采用植物生长调节剂或去除母本植株的营养生长中心。近年研究表明：提高亲本倍性水平，可能有利于胚珠发育。通过离体培养方法可以挽救可能(即将)败育的杂种胚。一般而言，达到心形期或以后的胚更易于培养成功。,80,湖北大学生命科学学院 陈建国,(二)、双二倍体的合成,获得种间杂种不一定就能在物种间进行遗传转移。物种间的不亲和性不仅表现在受精前、受精及受精后各过程中；亲缘关系较远的物种间杂种往往存在不同程度不育性；因而难以进行基因转移。事实上许多种间杂交试验都仅限于获得杂种F1。加倍杂种染色体数目，双二倍体中亲本染色

41、体均成对存在，可能产生可育配子；稳定双二倍体可作为新物种直接用于生产。但由于合成双二倍体往往常有野生种的不利性状，农艺价值降低。,81,湖北大学生命科学学院 陈建国,(三)、附加、代换、易位,绝大多数双二倍体遗传不稳定，只能作为进一步遗传转移的新起点和桥梁。在种间杂种及其双二倍体基础上，人们设计了许多染色体操作方案，以导入外源目的基因，并尽可能避免导入对受体有害的遗传物质。理想的情况是只掺入目的基因，而排除外源物种的其它基因。由于遗传重组可能性有限，所以导入整条染色体(异附加系、异代换系)是利用外源基因的一种重要方式。外源染色体上连锁的不利基因往往极大地限制附加系和异代换系的利用价值，因而可以

42、采用：辐射、遗传、单体附加等方式诱导外源染色体与栽培物种染色体易位。,82,湖北大学生命科学学院 陈建国,(四)、染色体工程中的现代技术,在传统远缘杂交的基础上采用的现代技术主要是：离体胚(子房)培养技术；植物染色体显带技术；染色体分子原位杂交技术等。染色体工程仍然是外源基因转移最有效、最接近实际应用的技术。,83,湖北大学生命科学学院 陈建国,*三、细胞工程,细胞工程的主要技术和研究领域包括：细胞、原生质体的分离、培养；细胞、原生质体植株再生；体细胞无性系变异的诱导、筛选与应用；以细胞、原生质体作为基因工程受体；细胞、原生质体融合、杂种细胞筛选、鉴定与应用。,84,湖北大学生命科学学院 陈建

43、国,(一)、细胞、原生质体植株再生,采用体细胞杂交在物种间进行遗传转移与应用的必要条件是：细胞、原生质体遗传全能性能充分实现，再生成新的生物个体。对植物而言，细胞和原生质体再生技术已经比较成熟。曾经是人们公认难题的禾本科植物原生质体再生在近二十多年来也已取得巨大进展。对动物而言，克隆羊“多利”的诞生表明：动物细胞(包括人体细胞)再生成为个体都是可能，其技术实现需要的仅仅是时间。,85,湖北大学生命科学学院 陈建国,(二)、植物原生质体作为基因工程的受体,最初常用的转基因受体有叶圆片、幼胚、愈伤组织等植物组织器官。在这些组织、器官中：细胞壁的存在会增加操作的难度；产生细胞嵌合体现象，难以筛选转化

44、子。因此原生质体是最具潜力的植物基因工程受体，转化效率高、筛选方便。,86,湖北大学生命科学学院 陈建国,(三)、细胞、原生质体融合,采用细胞、原生质体融合产生杂种细胞，通过诱导再生获得杂种个体(双二倍体)，可避免有性杂交障碍。动物细胞不具有细胞壁，细胞融合技术较植物成熟和成功。当然动物细胞融合都局限于获得杂种细胞及其无性细胞系。可以预见：用杂种细胞核代替维尔穆特获得克隆羊所采用的乳腺细胞核可以获得物种间杂种生物个体。人与小鼠杂种细胞的无性细胞系曾在人类基因染色体定位研究上发挥重要的作用。植物细胞融合由于细胞壁的存在而受到极大的限制。因此，去除细胞壁分离原生质体的技术是植物细胞杂交的基础。获得

45、杂种细胞及其再生植株后，即可进行物种间细胞核、染色体以及细胞器的转移。,87,湖北大学生命科学学院 陈建国,四、基因工程,基因工程是遗传工程，以至生物工程的核心内容和最前沿技术，最集中地体现了现代生物学理论和技术成就。限制性内切酶和载体是基因工程的众多理论与技术基础中最重要的基石。基因工程的基本步骤可以概括为：目的基因的获得(基因克隆)；目的基因与载体连接(DNA分子重组)；重组DNA分子导入受体；转化子的筛选、鉴定。,88,湖北大学生命科学学院 陈建国,限制性内切酶与DNA连接酶,细菌细胞内特异性降解外源(异源)核酸分子的核酸酶。其作用特点是：特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)；I类

46、限制酶随机切割双链DNA分子，II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列；II类限制酶交错切割DNA双链，产生粘性单链末端。来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接形成重组DNA分子。通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶。重组DNA技术是基因工程最核心的技术，贯穿于整个基因工程各个步骤中。,89,湖北大学生命科学学院 陈建国,载体(vector),用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆克隆载体；在基因导入受体时：将目的片段转移到受体细胞中并使之表达转化载体或表达载体。,常用基因工程载体

47、有：细菌质粒(克隆)；噬菌体(克隆)；柯斯质粒(克隆)；穿梭质粒(克隆/表达)；细菌人工染色体(克隆/表达)；酵母人工染色体(克隆/表达)；Ti质粒及其衍生载体(转化)。,90,湖北大学生命科学学院 陈建国,91,湖北大学生命科学学院 陈建国,(一)、目的基因的获得,基因工程最主要的特点是其定向性，也就是对特定的基因进行操作。因此分离目的基因并获得足够的拷贝数(基因克隆)是基因工程及相关研究工作的前提。1.基因库构建与目的基因分离；2.PCR扩增、克隆基因；3.化学法合成基因。获得目的基因后可进行的研究还包括：序列分析、结构分析、以及表达机制研究。,92,湖北大学生命科学学院 陈建国,克隆(c

48、lone)的含义,名词(pl.clones)：克隆、无性(繁殖)系。生物个体、细胞的无性繁殖系；同一基因或DNA片段的多份拷贝。动词(cloning)：克隆。细胞克隆：从单个细胞产生一组具有同样遗传组成的细胞；分子克隆：获得单个基因/DNA片段多份拷贝。常用的方法有将带有目的片段的重组DNA分子导入到特定宿主细胞中，利用宿主细胞DNA复制系统进行复制；利用DNA聚合酶在无细胞系统中复制(PCR,聚合酶链式反应)。,93,湖北大学生命科学学院 陈建国,基因库构建与目的基因分离,基因库(基因文库)：包含特定基因组所有基因、DNA区段的全部分子克隆的集合体。根据分子克隆中所含核酸片段的类型，基因库可

49、分为：核基因库、染色体库、cDNA库和线粒体库等。构建基因库的基本过程以及从基因库中筛选含目的基因克隆(亚克隆)的方法，本课程仅作为初步了解。分子克隆实验指南(分子生物学与基因工程研究作者的圣经)中译本有一千多页。,94,湖北大学生命科学学院 陈建国,(二)、转基因受体,转基因受体的种类和特性对目的基因导入、导入后筛选、受体的再生等都有很大的影响。植物基因工程常用受体包括：组织、器官、悬浮培养细胞、未成熟胚、合子以及原生质体等。可分别通过器官发生、胚状体或直接发育而获得转基因植株。动物基因工程受体主要有两类。一类是受精卵或早期胚胎。可以发育形成动物个体(转基因动物)。许多研究发现转基因动物获得

50、的性状可以稳定的遗传，表明外源基因可以整合到受体的染色体上。另一类受体是体细胞无性系。在“多利”诞生之前，这类受体仅局限于获得转基因细胞系供基因表达等的研究，也可用于药物生产。,95,湖北大学生命科学学院 陈建国,(三)、目的基因导入受体,将目的基因导入受体，并整合到受体染色体上是基因工程目标实现的关键环节。在基因工程研究领域的人们倾向于把所有将外源基因导入受体的过程称为转化(transforming)，将接受外源基因并整合到染色体上的细胞、个体称为转化体/转化子(transformant或transgenic)。最常用转化方法是：载体导入；理化方法导入(微注射、基因枪、电穿孔法、化学法)；还