DNA重组技术与基因操作 .ppt

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1、第三章 动物基因工程基础,限制性内切酶 克隆载体重组基因的导入和筛选获得真核生物目的基因的方法,基因工程研究的理论依据,不同基因具有相同的物质基础基因是可以切割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代,DNA重组技术要有四个必要条件：,工具酶、基因、载体、受体细胞,DNA限制性内切酶可分为三类：、酶在基因工程中基本不用,why?,第一节限制性内切酶,限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖

2、。,、限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于ATP的限制性内切酶活性。类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的、特异性切割末端。类酶在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离下来。,核酸内切限制酶的类型及其主要特性,一、II类限制性内切酶的特点,识别特定的核苷酸序列，其长度一般为4、5或6个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序列或兼并序列；具有特定的酶切位点，产生出特定的酶切末端5突出粘末端、3突出粘末端、平末端；类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带

3、有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做 粘性末端。,EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段,Sma特异识别CCCGGG,形成平末端,二、使用限制性内切酶时应注意的问题,1、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限制性内切酶。同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不同酶切位点的DNA片段重组提供了方便，但要注意，往往相容的粘性末端再用DNA连接酶连接后，都不能再被其切割了。,2、注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶解DNA样品。3、注意说明书中所列

4、出的comments的内容，会提供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化的信息以及引起酶产生star activity的原因。,star activity：指当酶的反应条件改变时，其在识别序列中的酶切位点发生改变。产生的原因：反应体系中甘油的浓度12；酶：DNA比率25u/g；缺少Nacl和存在Mn2。,4、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。一般以在20l反应体积中，37，每小时水解1微克DNA的酶量定为一个酶单位。5、注意酶在保温过程中的活性变化。ACC在5 小时内具有全部活力BamH在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部分活力，而在2小时以后就无活力了。Cfo仅在第一个小时

5、内具有全部活力，一个小时以后就没有活力了。,三、连接酶定义：用于将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。用途：（1）、连接带匹配粘末端的DNA分子；（2）、使平末端的双链DNA分子相互连接或与合成的寡核苷酸接头相连接。这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子（150-200mmol/LNacl）或低浓度的聚乙二醇（PEG）可提高连接效率。,DNA连接酶,连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。,四、修饰酶,1、DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I：3种催化活性klenow 大片段酶：2种催化活性T4噬菌体DNA聚合酶：2种催化活性T7噬菌体DNA聚合酶：2种催化活性耐

6、高温DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）反转录酶：3种催化活性末端脱氧核苷酸转移酶等,2、依赖于DNA的RNA聚合酶：SP6噬菌体及T7和T3噬菌体RNA聚合酶用途:在in vitro条件，合成单链RNA作为杂交探针,3、T4噬菌体多核苷酸激酶：催化ATP的磷酸基转移至DNA或RNA片段的5末端。用途：标记DNA片段的5端，制备杂交探针；基因化学合成中，寡核苷酸片段5磷酸化；用于测序引物的5标记。,532 P,OH 3,HO,32P,3,5,32P ATP,4、碱性磷酸酶：用途：去除DNA片段5末端的磷酸，以防止在重组中自身环化，从而提高重组效率；在用32pATP标记DNA或RNA的5末端前，

7、去除DNA或RNA片段的非标记的5磷酸。,5 P,OH 3,HO,P,3,5,5突出末端,5隐蔽末端,OH,HO,5HO,OH 3,3,5,第二节克隆载体,基因工程载体应具备的条件：能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；具有合适的限制性内切酶位点：在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源DNA片段方便的插入载体；在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源DNA插入片段：在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；应该有一个或多个选择标记。,大肠杆菌表达载体应具备：强的启动子，一个强的可诱导的启动子

8、可使外源基因有效的转录；在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD）；在外源基因插入序列的下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。,一、质粒(plasmid),定义：质粒是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。,A,OC,SC,L,质粒载体的基本要求,具有复制起点应包含一个可供选择的标记基因具有多克隆位点具有较小的分子量和较高的拷贝数,F质粒：有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息的质粒。R质粒：表达对一种抗生素的抗性的质粒。降解质粒：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因的质粒

9、。穿梭载体：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制。,1、质粒载体pBR322特点1）大小为4363bp；2）含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；3）有单一的BamH、Hind和Sal的识别位点（在四环素抗性基因内）、Pst识别位点（在氨苄青霉素抗性基因内）；外源片段在BamH、Hind、Pst位点插入时，可引起抗生素失活来筛选重组体。4）带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能，在大肠杆菌里pBR322以高拷贝数存在。,2、质粒载体pUC191）特征大小为2686bp；乳糖操纵子半乳糖苷酶带有pBR322的复制起始位点，一

10、个氨苄青霉素抗性基因；一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因的调节片段（lacZ）,一个调节lacZ基因表达的阻遏蛋白的基因lacI；含有多个单克隆位点。,2）pUC19的筛选：培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTG，lac操纵子的一个诱导物）时，lacI的产物就不能与lacZ的启动子区域结合，质粒pUC19的lacZ就可以转录，进而翻译，lacZ蛋白会与染色体DNA编码的一个蛋白形成具有活性的杂合半乳糖苷酶；在底物5溴4氯3吲哚半乳糖苷酶（X-gal）存在下，X-gal会被杂合半乳糖苷酶水解成蓝色的产物，没有插入外源DNA序列的pUC19质粒克隆就呈蓝色；由于pUC19的单克隆位点的序列是整

11、合在lacZ之中的，若pUC19质粒中插入有目的DNA片段，就会破环lacZ的结构，导致细胞无法产生功能性的lacZ蛋白，也就无法形成杂合的半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。,互补原理,载体：含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，并在编码序列中插入了一个MCS受体菌：为半乳糖苷酶C端序列编码互补：宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质 lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补,穿梭质粒:人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。,二

12、、噬菌体,噬菌体可以进入裂解循环，20分钟后就可使宿主细胞发生裂解，同时释放出大约100个噬菌体颗粒。,噬菌体也可以进入溶源循环，即注入的DNA整合到大肠杆菌的染色体中，以前噬菌体的形式潜伏起来，永久保留。,噬菌体DNA大约长50kb，其中大约20kb对于整合切割过程极为关键，称为整合切割（I/E）区域。对于构建文库，可将这20kbDNA片段去掉，强迫重组的噬菌体进入裂解循环。,噬菌体头的大小足以装下50kb单元的线性DNA，DNA52kb,则无法包装进头部cos位点（cos site）就是保证在超长线性DNA分子上每两个cos位点之间为50kb,使DNA分子能正确的装配进噬菌体 在头的入口处

13、有一种酶，它能识别双链线性DNA分子上的cos序列，并在cos序列处切断DNA分子，使适当大小的DNA进入噬菌体的头部,噬菌体DNA分子示意图,三、柯斯质粒（cosmid）可携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优势。柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个cos位点、DNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个cos位点之间含有一个限制性内切酶位点（RE）。,应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序,利用柯斯质粒克隆大片段DNA,四、YAC载体1、目前能容纳最大外源DNA片段的载体是YAC（酵母 人工染色体，yeast artificial chromo

14、some）。2、真核生物染色体三个关键部分：着丝粒（centromere,CEN）,它主管染色体在细胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；端粒（telomere,TEL）,位于染色体的末端，对染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶切断具有重要的意义；自主复制序列（autonomously replicating sequence,ARS）,即在染色体上的多处DNA复制起始位点。,3、作为真核基因表达载体应具备如下条件：含有原核基因的复制起始序列（如ColE1起始序列ori）筛选标记；含有真核基因的复制起始序列（如SV40病毒的复制序列、酵母的2质粒的复制起始序列ARS、以及真核细胞筛选标记（

15、如氨基糖苷G148抗性基因、在酵母细胞中与自养有关的基因）；含有有效地启动子序列（可包含增强子序列等各种顺式作用元件）；RNA聚合酶所需的转录终止和poly(A)加入的信号序列；合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。,4、YAC 的主要功能成份有三：,1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减数分裂同源染色体分离之必需2）端粒3）自主复制序列（ARS）元件4）构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，选择标记，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆,pYAC4结构图,第三节 受体细胞,接受遗传物质的细胞能摄取外源DNA并使其稳定存在，具有重要的应用价值和理论价值,一

16、、原核生物细胞表达系统,优点大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA导入没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质基因组小，遗传背景简单繁殖迅速，实验周期短，重复实验快,一、原核生物细胞表达系统,问题真核基因修饰DNA与细胞分裂的关系细胞的特异性分化热源、内毒素不易除去、产品难纯化包涵体提纯繁琐蛋白质复性困难，易出现肽链的不正确折叠,二、真核生物细胞表达系统,真核生物由多细胞组成，有明显的细胞分化和细胞核真核细胞的一条成熟的mRNA只能翻译出一条多肽存在大量的重复序列和内含子,1、真菌细胞表达系统,基因结构相对简单培养简单，适于大规模发酵生产表达产物能分泌到培养基中，便于产

17、物的提取和加工不产生毒素酵母菌,2、哺乳动物细胞表达系统,表达水平仅为细菌表达量的5%能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N端糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能,3、昆虫细胞及其幼体表达系统,良好的翻译后修饰功能表达产物接近天然的蛋白质构型,三、受体细胞的选择,避免外源DNA被修饰和降解无重组能力，重组DNA分子能稳定维持和表达具有较高的可转化性含有与载体的选择性标记相匹配的基因型，便于重组子的筛选感染寄生缺陷型，无致病性，不会对外界环境造成生物污染,第三节 重组基因的导入和筛选,DNA克隆的基本过程,分：分离目的基因切：对目的基因和载体适当切割接：目的基因与载体连接转：重组DNA转

18、入受体菌筛：筛选出含有重组体的受菌体,基因工程技术策略,分：基因载体 目的基因 质粒 噬菌体 病毒 直接分离 cDNA 人工合成 基因文库切：限制性内切酶 有缺口的载体 目的基因接：连接酶 粘端连接 平端连接 尾接法 重组体转：转化 转染 体外包装 带重组体的宿主筛：表型筛选 电泳法 核酸杂交,基因操作的基本步骤,1、细胞内总DNA的提取分离,细胞内总DNA的提取分离程序,紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。,2、基因重组的方法：,1）根据外源DNA片段末端的性质同载体上适当的酶切位点相连实现基因的体外重组。,外源DNA片段与载体的连接,2）当在载体的以及外源DNA片段两端的限制酶切位点

19、之间，不可能找到恰当的匹配时，可采用下述方法解决：在线状质粒的末端或外源DNA片段的末端用DNA连接酶接上接头或衔接头，这种接头可以是含单一的或多个限制性酶切位点，然后通过适当的限制酶解后进行重组。,使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分补平3凹端。3凹端转变成粘端。,5TCGA,AGCT5,xho I,5GATC,CTAG5,Sau3A I,5TCGA,AGCT5,CT,TC,5GATC,CTAG5,AG,GC,dCTP、dTTP、dATP、dGTP,Klenown酶,使用Klenow酶在4种dNTP存在下，将3凹端完全补平或用S1核酸酶、绿豆核酸酶、Klenow酶、T4DNA聚合

20、酶去除3突出端产生平端DNA分子，可与任何其他平端DNA分子相连。3）可以利用末端转移酶分别在载体酶切位点处和外源DNA片段的3端加上相互补的同聚尾同聚物加尾法，常用于双链cDNA的分子克隆。,Pst1,质粒,pG,CTGCA,ACGTC,Gp,CTGCAGGGGGG,pG,Gp,GGGGGGACGTC,AAAAAAA,mRNA,AAAAAAA,TTTTTTT,TTTTTTT,AAAAAAA,AAAAAAACCCCCC,TTTTTTT,CCCCCC,用末端转移酶加（dG）残基,用末端转移酶加（dC）残基,以oligo(dT)作引物合成cDNA第一链,合成cDNA第二链,退火,CTGCAGGGG

21、G,AAAAAAACCCCCC G,G CCCCCC,TTTTTTTGGGGGGACGTC,转化适当的大肠杆菌菌株选择抗生素抗性,转化过程中，DNA上的缺口为宿主酶所修复，从而在cDNA两端恢复Pst1位点,Pst1,Pst1,cDNA,4）多聚酶链反应（PCR）为基因定向重组和构建外源基因高效表达治理提供了一个通用方法。根据载体上的克隆位点设计PCR引物，使引物上带有与载体克隆位点相匹配的限制性内切酶识别序列。,3、重组DNA分子导入受体细胞,1)转化：由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，

22、就能提高转化效率,2)转导：通过噬菌体或病毒的感染作用将一个细胞的遗传信息传递到另一个细胞的过程用噬菌体活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖,3)转染：重组的噬菌体DNA也可像质粒DNA的方式进入宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2等处理成感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖也可用人工脂质膜包裹DNA，形成的脂质体可以通过与细胞膜融合而将DNA导入细胞,具体方法：氯化钙法电穿孔：将宿主细胞置于一个高强电场中，通过电场脉冲在细胞壁上打

23、孔，DNA分子随即进入细胞聚乙二醇介导的原生质体转化法：常用于转化酵母以及其他真菌细胞活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变成球形后，在适当浓度的聚乙二醇6000（PEG-6000）的介导下将外源DNA转化入受体细胞中,磷酸钙或DEAE葡聚糖介导的转染：将外源基因导入哺乳类细胞中瞬时表达的常规方法 磷酸钙和DNA共沉淀：将被转染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后可能通过内吞作用进入受体细胞 DEAE葡聚糖作用：可能是其与DNA结合从而抑制核酸酶的作用或与细胞结合从而促进DNA的内吞作用,原生质体融合：通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合脂质体法：将DNA

24、或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜融合将基因导入细胞核的显微注射法：即将目的基因重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中,4、一般克隆基因的检查和鉴定方法,琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力 不同迁移率分子量标准参照物,酶切和电泳方法,1）、重组质粒的快速鉴定：根据有外源基因插入的重组质粒同载体DNA之间大小的差异区分。2）、重组质粒的限制酶解分析。3）、通过互补使菌落产生的颜色反应来筛选重组体。,标志补救（marker rescue）若目的基因能够在宿主菌表达，且表达 产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对 营养素的依赖

25、表型来筛选。,宿主生长 依赖Leu重组体+目的基因 能够合成Leu 在没有Leu存在时 能生长（已转化）重组体转化的细菌中 在没有Leu存在时 不生长（没有转化）,4)、外源DNA片段插入失活如果载体带有两个或多个抗生素抗性基因并在其上分布适宜的可供外源DNA插入的限制性内切酶位点时，当外源DNA片段插入到一个抗性基因中去时可导致此抗性基因失活。,5)、分子杂交筛选法：,原位杂交点杂交和southern杂交,A.核酸的分子杂交技术在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的常用的滤膜有尼

26、龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）,B.两个步骤将核酸样品转移到固体支持物滤膜上 核酸印迹(nucleic acid blotting)转移 主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。,（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析,Southern杂交,A.

27、DNA体外重组实验 B.抗生素筛选转化子细胞 C.培养突变株细胞 D.Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中,Southern杂交分析示例,6)、表达文库的免疫学筛选：绝大多数构建噬菌体的cDNA文库选用gt11、ZAP或ORF8作为表达载体这些噬菌体带有一拷贝的大肠杆菌LacZ基因，克隆位点位于翻译终止密码子上游53bp处cDNA插入方向和阅读框正确时，可以表达氨基端为半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融合蛋白，其中一些外源序列将暴露出可用特异抗体检测的抗原表位,LacZ,+,EcoRI,EcoRI,EcoRI,LacZ,gt11重组文库,感染,在培养基上培养菌落

28、,转膜,菌落的蛋白质裸露出来,一抗与裸露的蛋白质结合,二抗与一抗结合,显色,找出阳性克隆,裂解,加一抗,洗去游离的一抗，加二抗,洗去游离的二抗，加显色剂,7)、利用PCR方法来确定基因的重组体,克隆PCR产物；通用引物：pUC/M13 primer,8)、DNA的序列分析：这是最后确定分离的基因是否具有与天然基因相同序列的唯一方法，也是最确定的方法,第四节 获得真核生物目的基因的方法,鸟枪法cDNA的方法DNA的化学合成利用PCR或RT-PCR分离基因,一、鸟枪法（shot gun）,A.染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接

29、，但有可能使 目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整B.与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体.,C.转化受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞D.筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分

30、离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离.,鸟枪法操作的改进,1、使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率.,2、在连接前将DNA片段进行分级分离例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接,鸟枪法克

31、隆目的基因的局限性,工作量较大，需要了解目的基因的背景知识,不能获得的最小长度的目的基因,不能除去真核生物目的基因的内含子结构,二、cDNA的方法1、分离表达目的基因的组织或细胞：所用材料要尽量新鲜2、mRNA的分离3、第一链cDNA链的合成4、第二条cDNA链的合成5、cDNA的甲基化和接头的加入6、双链cDNA与载体相连：插入片段：载体1：13：17、基因文库的建立,1、mRNA的分离 poly(A)尾巴可以用来把mRNA同rRNA和tRNA分离开来：1)、先提取真核细胞的总RNA；2)、把总RNA通过一个用纤维素填充的柱子；在纤维素上结合有许多长度大约为15个核苷酸的短链寡聚dTolig

32、o(dT)或dT15，真核基因mRNA分子的poly(A)尾巴通过碱基配对作用与oligo(dT)结合，而其它的RNA成分因为没有poly(A)尾巴而不能结合 3)、真核生物mRNA可以用能打断A-T氢键的缓冲液洗脱下来。,2、第一链cDNA链的合成mRNA纯化以后，样品中加入短的oligo(dT)或随机引物分子作为引物，同时加入逆转录酶、缓冲液和4种脱氧核糖核苷三磷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。优点：可以最大限度的减少poly(A)模板合成 cDNA的可能性；缺点：cDNA合成总是从mRNA3端开始，在最后的cDNA文库中，代表mRNA3区域的组分所占的比例会高，而且对于一些

33、较长的mRNA分子来说，由于反转录酶在cDNA合成过程中易从mRNA分子上脱开，从而造成第一条链合成不完整。,优点：合成的cDNA文库可能更好地代表最初RNA模板 所代表的组份；缺点：由于cDNA在RNA链上的合成是随机的，易产生较大量的非全长的RNA模板转录物，从而影响到全长的cDNA分子的获得率。因此用总体RNA和oligo(dT)引物是最有效的组合。用逆转录酶在体外合成的DNA链往往不完整，但有一个特点：在合成停止前，DNA链会自己折转回来几个核苷酸形成一个发夹结构。,随机引物,3、第二条cDNA链的合成自身引导法：利用经一条链上的3端序列的折回或发卡自引导法来合成效率低，目前已不多用。

34、cDNA第二条链的置换合成法：作为第一条链合成反应产物的cDNA：mRNA杂交分子充当切口平移的模板。RNaseH在杂交分子上的mRNA链上造成切口，产生一系列的RNA引物，它们被E.coli的DNA聚合酶I用以合成第二链效率高，直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化；省去S1酶的处理，改善了cDNA的质量，使产生全长的cDNA的机率大大提高。引物衔接头法合成双链cDNA：通过将cDNA两端加上限制性内切酶位点，使其较方便的克隆入相应的载体。,自身引导法,反转录酶,RNaseH（部分降解）,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA连接酶,RNA,5,5cDNA第一链,3,3RNA,5,5,5,

35、5,5,5,5,5cDNA第一链,3cDNA第二链,置换合成法,4、基因文库的建立基因文库：指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后（必要时对这些DNA片段进行密度梯度离心或经制备型凝胶电泳进行分级分离，以选择长度适合于插入载体的片段）所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。,基因组DNA文库存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。简称G文库。,cDNA文库用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。简称c文库。,三、DNA的化学合成,1、基因片段的全化学合成特点：首先合成组成一个基因的所有片段，相邻

36、的片段间有46碱基的重叠互补，在适当的条件下经退火后，用T4DNA连接酶将各片段以磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完整的基因。化学合成的DNA片段纯化后其5和3端都为羟基，在组建基因前要将DNA片段的5端磷酸化（处于基因5端的两个寡核苷酸片段不进行磷酸化，以防止基因本身在DNA重组时自身环化）。,化学合成的不足之处在于：（）要已知基因的核苷酸顺序；（）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（）价格昂贵。,基因的化学合成及克隆图解,退火,DNA连接酶,Amp,Tet,Ampr Te

37、tt,合成的基因,2、基因的化学酶促合成特点：不需要合成组成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片断，相邻的3末端有一短的序列互补，在适当的条件下通过退火形成模板引物的复合体，然后在存在四种dNTP的条件下，用E.coli的DNA聚合酶大片段（klenow大片段）去填补互补片段之间的缺口，最后用T4DNA连接酶连接及适当的限制性内切酶切割后重组入载体。,基因的化学酶促合成图解,退火,DNA多聚酶Iklenow片段dNTP,限制性内切酶,分子克隆,5,5,5,5,1、PCR技术的发明,PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mullis教授 开汽车时的联想,逶迤崎岖的山路DNA双螺旋 行驶

38、的汽车一小段DNA引物 1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖,四、利用PCR或RT-PCR分离基因,2、PCR原理根据已知的待扩增的DNA片段序列，人工合成与该DNA两条链末端互补的两段寡核苷酸引物，在体外有模板DNA和4种脱氧核糖核苷存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促作用扩增DNA。,Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，,PCR 动画,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变 性,引 物 退 火,DNA 复制,1、反应体系具备的条件：要有与被分离的目的基因5和3

39、端序列互补的DNA 引物（约20个碱基左右）；具有热稳定性的酶，如Taq DNA聚合酶；dNTP；作为模板的DNA分子。,2、过程：变性：模板DNA置于95的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链；退火：将反应体系的温度降至55左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对；延伸：将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。,3、引物设计原则：3末端序列不能有明显的互补性易造成引物间二聚体，导致非特异DNA片段的合成；避免引物分子内序列互补导致引物分子内双链区或发夹环结构的形成，引物3端形成的发夹环会引起引物内延伸，而发生在近5端对P

40、CR的影响不大；注意熔点温度。注意引物内稳定性：5末端稳定而其3末端不稳定的引物是进行PCR合成的好引物。当利用哺乳动物类基因组序列作为PCR模板时，对所用的引物要检查其同Alu序列或其它短的重复序列的互补性。,4、逆转录PCR（retrotranscription PCR,RT-PCR）,以RNA为模板，经逆转录获得与RNA互补的DNA链即cDNA,然后以cDNA链为模板进行的PCR反应。,帽子,AAAAA mRNA,3,5,TTTTT,以其为模板进行PCR扩增,逆转录,合成cDNA互补链并退火,寡聚dT引物,优点：是检测RNA分子的良好方法，也是获取测序用模板DNA的有效手段，同时还是克隆

41、mRNA之cDNA的重要步骤RT-PCR具有很高的敏感性,可以用来分析不同组织或是相同组织不同发育阶段中mRNA表达状况的相关性可以用来研究低表达活性基因的mRNA生理变化动态,判断 根据琼脂糖凝胶电泳中样品条带的强度比较，便能确定两种PCR反应产物之间的数量关系前提条件 所测定的mRNA分子必须来自由一个或数个间隔子的基因,5、锚定PCR,特别适合预扩增那些只知道一段序列的目的DNA对于一端序列已知，一端序列未知的DNA片段，可以通过DNA末端转移酶给未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后用多聚dC和已知序列作为引物进行PCR扩增,5,3,DNA序列,锚定引物,CCCCC（多聚dC引物

42、）,进行PCR扩增,5,GGGGG 3,CCCCC,加多聚dG尾巴,加入引物,已知序列,扩出的未知序列,6、反向PCR,特别适合用于扩增已知序列两端的未知序列方法：选择一个在已知序列中没有，而在其两侧都存在的限制性内切酶位点，用相应的限制性内切酶酶解后，将酶切的片段在连接酶的作用下环化，使得已知序列位于环状分子上，根据已知序列的两端序列设计两个引物，以环状分子为模板进行PCR，就可以扩增出已知序列两侧的未知序列。,L,R,酶切位点,酶切位点,L,R,已知序列,限制性内切酶酶解,环化,RE,a,b,a,d,c,d,c,直接测序或克隆后再测序,五、外源基因在宿主细胞中的高效表达,有效的转录起始外源

43、基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一选择强的可调控的启动子及相关的调控序列在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻碍，可避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起细胞死亡问题当细胞数目达到一定的密度，通过各种诱导（温度、药物等）使阻遏物失活，RNA聚合酶快速启动,有效的转录起始T7噬菌体启动子:T7RNA聚合酶几乎能完整地转录在T7启动子控制下的所有DNA序列真核细胞的表达载体：启动子、增强子,mRNA的有效延伸和转录终止转录物内的衰减和非特异性终止可诱发转录中的mRNA分子提前终止衰减子：负调控元件，尽量避免非特异性终止：加入抗终止元件正常的转录终止子防止不必要的转录，

44、使mRNA的长度限制到最小，增加表达质粒的稳定性真核细胞含有转录终止序列和poly(A)加入位点,mRNA的稳定性mRNA的稳定性直接关系到翻译产物的多少原核细胞利用RNase缺失的受体菌真核细胞使mRNA 5端和3端正确加工，提高成熟mRNA的稳定性,有效的翻译起始多种成分协同作用的过程，包括mRNA、16sRNA、fMet-tRNA之间的碱基配对达到最大效率的一般原则AUG是最首先的起始密码子，GUG、UUG、AUU、AUA有时也用，但非最佳选择SD序列：至少含有AGGAGG序列中的四个碱基SD序列与起始密码之间的距离以93为适宜处于起始密码5端的核苷酸应该是As和Us（3位置应为A）如果

45、在起始密码AUG后的序列GCAU或AAAA序列，能使翻译效率提高翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构,有效的翻译起始真核细胞共有序列5-CC CCATGG-3是必需的3位应是嘌呤碱基，4位是G在起始密码的上游区存在另一个起始密码，又不被其后的一个符合读框的终止密码所隔断，这个上游起始密码会损害翻译的起始,AG,遗传密码应用的偏倚性对遗传密码的应用不是随机对高表达的基因经常使用偏倚性密码基因编码序列的5端，使用偏倚密码更能提高表达效率mRNA的二级结构破坏mRNA的5-未翻译区的茎环结构，增强翻译起始效率,RNA的加工内含子包含有增强子或其它顺式调控元件剪接增加了mRNA在核内的稳定性，导

46、致在细胞质中积累更多成熟的mRNA含有使染色体功能域开放的序列，可能通过影响核质成分、位置等来提高基因的表达mRNA序列上终止密码的选择UAA终止效率最好一串联的终止密码,表达质粒（或载体）的拷贝数及稳定性选择高拷贝质粒通过反式作用因子同复制起点相互作用或通过标记基因加选择压力，使目标基因得以扩增，从而提高基因的表达水平尽量减少表达载体的大小建立可整合到染色体中的载体,外源蛋白的稳定性在宿主细胞中稳定积累，不被内源蛋白水解酶降解组建融合基因，产生融合蛋白产生可分泌的蛋白以包涵体形式表达选择合适的受体系统,用同聚物加尾法再生Hind识别位点,AAGCTT,TTCGAA,载体分子,3,5,加Hin

47、d酶,A,AGCTT,TTCGA,A,5,5,3,3,5,5,AAGTC,AGCTT,TTCGA,TGCAA,5,3,5,3,dNTPs+Klenow酶,待克隆的DNA片段,5,3,加dATP末端转移酶poly(dA)加尾,加dATP末端转移酶poly(dT)加尾,(n)AAA,+,连接酶,AAGCTTT(n),(n)AAAGCTT,TTCGAAA(n),(n)TTTCGAA,5,3,5,3,Hind位点,作业,1、名词解释 限制性内切酶、质粒、柯斯质粒、酵母人工染色体、基因文库、逆转录PCR、锚定PCR、反向PCR、2、II类限制性内切酶的特点；3、基因工程载体应具备的条件；4、互补原理筛选重组子；5、基因导入方法；6、外源DNA片段插入失活原理；7、基因工程基本步骤；8、获得真核生物目的基因的方法。,