《酵母基因工程》PPT课件.ppt
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1、第十五章 酵母基因工程,五、酵母菌的表达系统,第十五章 酵母基因工程,三、酵母菌的载体系统,二、酵母菌的宿主系统,一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,六、利用重组酵母生产乙肝疫苗,四、酵母菌的转化系统,一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌的分类学特征,酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细,胞真核生物,分属于子囊菌纲(子囊酵母菌)、担子菌纲(担子酵母,菌)、半知菌类(半知酵母菌),共由56个属和500多个种组成。如,果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统,则酵母菌是最,成熟的真核生物表达系统。,一、酵母菌作为表达外源基因受
2、体菌的特征,2、酵母菌表达外源基因的优势,全基因组测序,基因表达调控机理比较清楚,遗传操作简便,能将外源基因表达产物分泌至培养基中,具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统,大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉,不含有特异性的病毒、不产内毒素,美国FDA认定为安全的,基因工程受体系统(Generally Recognized As Safe GRAS),酵母菌是最简单的真核模式生物,第十五章 酵母基因工程,二、酵母菌的宿主系统,2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
3、,第十五章 酵母基因工程,1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括:,酵母属 如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis),毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe),汉逊酵母属 如多态汉逊酵母(Hansenula polymorpha),其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽,但巴斯德毕赤酵母,表达外源基因最理想。,2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主
4、菌,能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型,ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶,ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工,rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平,ose1 提高重组蛋白表达 转录水平,ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Y,rho-提高重组蛋白表达 转录水平,突变类型,生物效应,作用位点,3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,能抑制超糖基化的突变类型,mnn 甘露糖生物合成缺陷型,alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型,och 外侧糖链添加缺陷型,突变类型,生物效应,许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团,,它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单
5、位由糖基核心和外侧糖,链两部分组成。,酵母菌普遍拥有蛋白,质的糖基化系统,但野生,型酿酒酵母对异源蛋白的,糖基化反应很难控制,呈,超糖基化倾向,因此超糖,基化缺陷株非常重要。,4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,(1)泛素、介导的蛋白质降解作用,蛋白酶体,Lys,Ubiquitin 76 aa,ubiquitin ligase E3,Lys,ubiquitin ligase E3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,(2)酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因,酵母菌共有四个泛素编码基因:,UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52(CEP52)对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 2 编码泛素
6、-羧基延伸蛋白52(CEP52)对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76(CEP76)对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达,酵母菌共有七个泛素连接酶基因:,UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7,(3)泛素降解途径衰减的酿酒酵母,在酿酒酵母菌中,泛素主要由UBI 4基因表达,UBI 4-突变株能,UBI 4缺陷型:,正常生长,但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多,,因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体,UBA 1缺陷型:,UBA1编码泛素激活酶E1,UBA1突变
7、株是致死性的,但其等位,基因缺陷是非致死性的,而且也能削弱泛素介导的蛋白降解,Ubc4-ubc5 双突变型:,七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效,三、酵母菌的载体系统,酵母菌克隆表达质粒的构建,酵母菌中的野生型质粒,第十五章 酵母基因工程,酵母菌中的野生型质粒,酿酒酵母中的2m环状质粒,几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链,同源重组,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,B,环状质粒,拷贝数达50至100个。,IRs 反向重复序列,600 bp,重组,FLP 编码产物驱动IRs的同源重组,REP 编码产物控制质粒的稳定性,STB REP的结合位点,接
8、合酵母属中的pSR1和pSB1,以及,克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质,粒类似。,酵母菌中的野生型质粒,乳酸克鲁维酵母中的线状质粒,乳酸克鲁维酵母中含有两种不同,pGKL1 8.9 kb,DNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亚基,的双链线状质粒pGKL1和pGKL1,拷贝数为50-100个,分别携带K1,K2两种能使多种酵母菌致死的毒,反向重复序列,素蛋白编码基因(a b g),同时含有毒素蛋白抗性基因。,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有ARS的YRp质粒的构建,ARSkb,染色体上每30-40kb,就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标,记基因、提供克隆位点
9、的大肠杆菌质粒DNA。,以ARS为复制子的质粒称为YRp,上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个,但培养几代,以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp,后,质粒的丢失率高达50%-70%,主要是由于分配不均匀所致。,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有CEN的YCp质粒的构建,CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列,将CEN DNA插入含ARS的质粒中,获得的新载体称为YCp,YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性,但拷贝数只有1-5个,含有TEL的YAC质粒的构建,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建,在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色
10、体DNA特定序列和标记基因,,构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定,序列中,这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域,四、酵母菌的转化系统,2、转化质粒在酵母细胞中的命运,1、酵母菌的转化程序,3、用于转化子筛选的标记基因,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌的转化程序,(1)酵母菌原生质体转化法,早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化,法,在Ca2+和PEG的存在下,转化细胞可达原生质体总数的1-2%。,但该程序操作周期长,而且转化效率受到原生质再生率的严重制约,原生质体转化法的一个显著特点是,一个受体细胞可同时接纳,多个质粒分子,而且
11、这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%,1、酵母菌的转化程序,(2)碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化,酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子(如Li+等)、PEG、热休克,处理后,也可高效吸收质粒DNA,而且具有下列特性:,吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA,两者相差80倍,共转化现象极为罕见,1、酵母菌的转化程序,(3)酵母菌电击转化法,酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA,,但在此过程中应避免使用PEG,它对受电击的细胞具有较很大的负,作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件,适用范围广,而且转化率可高达105/mg DNA。,2、转化质粒在酵母
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