《酵母基因工程》PPT课件.ppt

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1、第十五章 酵母基因工程,五、酵母菌的表达系统,第十五章 酵母基因工程,三、酵母菌的载体系统,二、酵母菌的宿主系统,一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,六、利用重组酵母生产乙肝疫苗,四、酵母菌的转化系统,一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌的分类学特征,酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细,胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母,菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如,果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最,成熟的真核生物表达系统。,一、酵母菌作为表达外源基因受

2、体菌的特征,2、酵母菌表达外源基因的优势,全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便,能将外源基因表达产物分泌至培养基中,具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统,大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉,不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的,基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）,酵母菌是最简单的真核模式生物,第十五章 酵母基因工程,二、酵母菌的宿主系统,2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌

3、,第十五章 酵母基因工程,1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：,酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）,毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）,裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）,汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）,其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母,表达外源基因最理想。,2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主

4、菌,能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型,ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶,ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工,rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平,ose1 提高重组蛋白表达 转录水平,ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Y,rho-提高重组蛋白表达 转录水平,突变类型,生物效应,作用位点,3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,能抑制超糖基化的突变类型,mnn 甘露糖生物合成缺陷型,alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型,och 外侧糖链添加缺陷型,突变类型,生物效应,许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，,它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单

5、位由糖基核心和外侧糖,链两部分组成。,酵母菌普遍拥有蛋白,质的糖基化系统，但野生,型酿酒酵母对异源蛋白的,糖基化反应很难控制，呈,超糖基化倾向，因此超糖,基化缺陷株非常重要。,4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,（1）泛素、介导的蛋白质降解作用,蛋白酶体,Lys,Ubiquitin 76 aa,ubiquitin ligase E3,Lys,ubiquitin ligase E3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,（2）酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因,酵母菌共有四个泛素编码基因：,UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 2 编码泛素

6、-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达,酵母菌共有七个泛素连接酶基因：,UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7,（3）泛素降解途径衰减的酿酒酵母,在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能,UBI 4缺陷型：,正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，,因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体,UBA 1缺陷型：,UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变

7、株是致死性的，但其等位,基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解,Ubc4-ubc5 双突变型：,七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效,三、酵母菌的载体系统,酵母菌克隆表达质粒的构建,酵母菌中的野生型质粒,第十五章 酵母基因工程,酵母菌中的野生型质粒,酿酒酵母中的2m环状质粒,几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链,同源重组,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,B,环状质粒，拷贝数达50至100个。,IRs 反向重复序列，600 bp，重组,FLP 编码产物驱动IRs的同源重组,REP 编码产物控制质粒的稳定性,STB REP的结合位点,接

8、合酵母属中的pSR1和pSB1，以及,克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质,粒类似。,酵母菌中的野生型质粒,乳酸克鲁维酵母中的线状质粒,乳酸克鲁维酵母中含有两种不同,pGKL1 8.9 kb,DNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亚基,的双链线状质粒pGKL1和pGKL1,拷贝数为50-100个，分别携带K1,K2两种能使多种酵母菌致死的毒,反向重复序列,素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有ARS的YRp质粒的构建,ARSkb，染色体上每30-40kb,就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标,记基因、提供克隆位点

9、的大肠杆菌质粒DNA。,以ARS为复制子的质粒称为YRp,上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代,以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp,后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有CEN的YCp质粒的构建,CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列,将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp,YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个,含有TEL的YAC质粒的构建,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建,在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色

10、体DNA特定序列和标记基因，,构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定,序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域,四、酵母菌的转化系统,2、转化质粒在酵母细胞中的命运,1、酵母菌的转化程序,3、用于转化子筛选的标记基因,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌的转化程序,（1）酵母菌原生质体转化法,早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化,法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。,但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约,原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳,多个质粒分子，而且

11、这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%,1、酵母菌的转化程序,（2）碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化,酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克,处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：,吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍,共转化现象极为罕见,1、酵母菌的转化程序,（3）酵母菌电击转化法,酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，,但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负,作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件,适用范围广，而且转化率可高达105/mg DNA。,2、转化质粒在酵母

12、细胞中的命运,单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍,含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制,不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体,这对于体内定点突变酵母基因组极为有利,克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体,DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总,数的50-80%,3、用于转化子筛选的标记基因,用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和,显性基因两大类,营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：,LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE,但对于多倍体酵母来说，

13、筛选营养缺陷型的受体非常困难,营养缺陷型的互补基因,3、用于转化子筛选的标记基因,显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白,显性标记基因,aph 氨基糖苷转移酶 抗G418,cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素,dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺,cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子,suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖,ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂,标记基因,编码产物,遗传表型,五、酵母菌的表达系统,2、外源基因在酵母菌中表达的限制因素,1、酵母菌启动子的可控性,3、酵母菌表达系统的选择,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌启动子的可控性,pho4TS-PHO5启动子：,

14、酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开,PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子,因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35时关闭,23诱导表达,（1）温度控制型启动子,PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35时失活,1、酵母菌启动子的可控性,a a 型启动子：,酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达编码a2因子的基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型,温度控制型启动子,a 型启动子,hmla2-

15、102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型启动子,受体细胞基因组 重组质粒,a 型启动子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型启动子,a2,a1,25,35,1、酵母菌启动子的可控性,酿酒酵母,（2）超诱导型启动子,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达,GAL10,Promoter,的半乳糖,利用酶系,由GAL1,GAL7和,GAL10,基因编码,2、外源基因在酵母菌

16、中表达的限制因素,外源基因稳态mRNA的浓度,外源基因mRNA的翻译活性,酵母菌对密码子的偏爱性,在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶,GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%,以上的氨基酸是由25个密码子编码的,3、酵母菌表达系统的选择,酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油,醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢,酿酒酵母表达系统,酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。,酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得,有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能,大量分泌

17、。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。,3、酵母菌表达系统的选择,乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源,蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也,乳酸克鲁维酵母表达系统,能稳定遗传40代以上。,乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优,于酿酒酵母表达系统。,3、酵母菌表达系统的选择,巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生,巴斯德毕赤酵母表达系统,长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长,迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯,德毕赤酵母表达系统的三大优势。,由于巴斯德毕赤酵母

18、没有合适的自主复制型载体，所以外源基因,的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因,具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。,的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种,3、酵母菌表达系统的选择,多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被,多型汉逊酵母表达系统,克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载,体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒,能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多,目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获,个拷贝，因此重

19、组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。,得成功表达。,六、利用重组酵母生产乙肝疫苗,由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重,的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其,中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒,还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒,感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其,广泛应用提供了可靠的保证。,第十五章 酵母基因工程,六、利用重组酵母生产乙肝疫苗,2、产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,1、乙型肝炎病毒的结构与性质,3、产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,1、乙型肝炎病

20、毒的结构与性质,乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染力的病毒,乙型肝炎病毒的结构,颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要,结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化,和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、,除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22,病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。,nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的,1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。,1、乙型肝炎病毒的结构与性质,乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因,ATG,ATG,ATG,

21、TAA,108 aa,55 aa,226 aa,preS1,preS2,S,S 多肽,226 aa,M 多肽,281 aa,L 多肽,399 aa,1、乙型肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫,传统乙肝疫苗的制备,苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的,疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。,2、产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括,将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活,性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存

22、在，平,均颗粒直径为 22 nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中,的病毒颗粒相同。,目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化,重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。,进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作,用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对 S抗,原缺乏响应的人群的免疫反应。,3、产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建,PARS2,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,Bgl II,pBSAG151,11 kb,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,his+的转化子,重组分子,转化his-的受体细胞,染色体DNA,3、产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,重组巴斯德毕赤酵母的性能,由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因,AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。,重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲,醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%,在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐,中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝,疫苗。,