三 谷氨酸生产菌及扩大培养.ppt

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1、三 谷氨酸生产菌及扩大培养,教学内容,1，了解谷氨酸生产菌的主要特征、特点。2，掌握菌种的扩大培养方法。3，了解影响生产菌生长的主要因素。,教学目的与要求,学时：4,作业安排,小论文,前言：,一，谷氨酸菌种的选育进展：1，应用常规育种技术及其所选育的谷氨酸高产新菌种,前言：,2，谷氨酸生产菌抗噬菌株的选育,前言：,3，采用遗传工程新技术选育谷氨酸优良菌种,前言：,二，谷氨酸生产菌保存方法,1，几种斜面培 养基 保存方法,前言：,二，谷氨酸生产菌保存方法,2磷酸盐缓冲液保存方法的改进,前言：,二，谷氨酸生产菌保存方法,3试管熔封法保存谷氨酸菌种的研究,前言：,二，谷氨酸生产菌保存方法,4液氮超低

2、 温保 存谷氨酸菌种,第一节 谷氨酸生产菌的主要特征和菌学性质,一，现有谷氨酸生产菌的分类：,现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。这四个属在细菌的分类系统中彼此比较接近。短杆菌属隶属于短杆菌科(Brevibacteriaceace)，而棒状杆菌属、小杆菌属及节杆菌属则都隶属于棒状杆菌科(corynebacteriaceae)。短杆菌科和棒状杆菌科均属于真细菌目中的革兰氏染色阳性、无芽抱杆菌及有芽抱杆菌的一大类。,二，现有谷氨酸生产菌的菌学性质：,三，现有谷氨酸生产菌的主要特征：,三，现有谷氨酸生产菌的主要特征：,三、现有谷氨酸生产菌的主要特征（总结）,第二节

3、 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化,人们发现，谷氨酸生产菌在发酵过程中会发生明显的菌体形态的变化。实践证明，在发酵过程中发现菌体形态有明显的变化时，正是产谷氨酸的激增时间。但在发酵培养基含有过剩生物素的培养条件下，菌体形态则没有明显变化，却呈现耗糖、长菌、不产谷氨酸的异常发酵。,一、种子的菌体形态,斜面和一、二级种子培养在不同培养条件下,细胞形态基本相似。斜面培养的菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮，革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状，有的微呈弯曲状，两端钝圆，无分枝；细胞排列呈单个、成对及“V”字形，有栅状或不规则聚块；分裂的细胞大小为0.70.9*1.03.4um。由于生物素充足，繁

4、殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。,二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态,从谷氨酸发酵中菌体形态的变化来看,大致可以分为长菌型细胞、转移期细胞和产酸型细胞3种不同时期的细胞形态。,三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态,发酵前期感染噬菌体后，菌体细胞明显减少,细胞不规则，发圆、发胖，缺乏“”字形排列，有明显的细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网，互相堆在一起，几乎找不到完整的菌体细胞,类似蛛网或鱼翅状。在发酵中、后期感染噬菌体后，菌体细胞形态不规则，边缘不整齐，有的边缘似乎有许多毛刺状的东西，有细胞碎片。,第三节 谷氨酸生产菌的育种,1，日常菌种工作,第三节 谷氨酸生产菌的育种,育种思路,第三节 谷氨酸

5、生产菌的育种,育种思路1.切断或减弱支路代谢 2.解除自身的反馈抑制 3.增加前体物的合成 4.提高细胞膜的渗透性 5.强化能量代谢6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株,第三节 谷氨酸生产菌的育种,2，选育耐高渗透压的菌株,第三节 谷氨酸生产菌的育种,3，选育不分解利用谷氨酸的突变株：即选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱的突变株。,第三节 谷氨酸生产菌的育种,4，选育细胞膜渗透性好的突变株,第三节 谷氨酸生产菌的育种,5，选育强化CO2固定反应的突变株,第三节 谷氨酸生产菌的育种,6，选育减弱乙醛酸循环的突变株,第三节 谷氨酸生产菌的育种,7，选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到a-酮戊二酸

6、代谢的突变株,第三节 谷氨酸生产菌的育种,8，选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株,第三节 谷氨酸生产菌的育种,9，选育强化能量代谢的突变株,第三节 谷氨酸生产菌的育种,10，选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株,第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,一、应用原生质体融合新技术选育谷氨酸生产菌,1)标记菌株的筛选；2)原生质体的制备；3)原生质体的再生；4)原生质体的融合；5)融合子的选择；6)实用性菌株的筛选。,第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,二，应用转化法选育谷氨酸生产菌,所谓转化，是指受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNA片段，并将它整合到自己的基因组中，从而获

7、得了供体细胞部分遗传性状的现象。转化作用需要受体菌和转化DNA。转化既是进行细菌遗传分析的有效工具，亦是微生物育种的有效方法。,第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,三，应用转导法选育谷氨酸生产菌,所谓转导，是指通过温和型噬菌体为媒介，将供体细脑中的DNA片段携带到受体细胞中，从而使受体细胞获得了供体细胞部分遗传性状的现象。转导作用需要三个组成部分，即供体菌，转导噬菌体，受体菌。由于绝大多数细菌(包括谷氨酸生产菌在内)都有噬菌体，所以转导远较转化作用普遍。又因为转导DNA位于噬菌体蛋白质外壳内，所以不会像转化DNA那样容易被外界的DNA分解酶所破坏，因此比较稳定。转导同转化一样，也是微生

8、物育种的有效方法。,第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,四、应用重组DNA技术选育谷氨酸生产菌,重组DNA技术也称为基因工程，它是在分子遗传学理论的基础上发展起来的。它综合了生物化学和微生物学的现代技术和手段在离体条件下将某种生物的基因与作为载体的DNA分子连接起来，然后转化到某一寄主细胞中，使之进行复制并得以表达，从而使寄主菌获得新的遗传性状。利用重组DNA技术，可以使编码限速酶的基因扩增以排除生物合成途径中的“瓶颈”，从而使谷氨酸产量增加。因比重组DNA技术是提高谷氨酸产量的一种新的有效手段。,第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,五、应用固定化细胞技术发酵生产谷氨酸,固定化

9、细胞是60年代后期发展起来的一项新技术，是通过物理的或化学的方法将细胞束缚在一定区间内使之仍具有催化活性的固定化生物催化剂。由于它既能保持酶或微生物细胞的催化功能，又能使细胞很方便地与反应液分离，并能进行重复使用，所以对原材料的合理利用，缩短不必要的操作时间，防止环境污染及进行现代化的工业生产部具有重要的现实意义。,举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B44,在谷氨酸生产中，依其代谢途径，把不必要的代谢途径(经诱变阻断了a一酮戊二酸到琥珀酰CoA和乙醛酸两条代谢途径)切断后，同时诱变出细胞渗漏型甘油缺陷 B 4，以便让谷氨酸有效外漏，解除因代谢途径改变后细胞内代谢产物谷氨酸过度积累而产生的反馈抑

10、制，谷氨酸产量有一定提高(经诱变筛选得到的营养缺陷型突变株 B 4比其出发菌株 B l提高产酸率 18.6 和对糖的转化率提高 12.3)。,举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B44,举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B44,1.1，菌株和质粒,举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B44,1.2 培养基和培养条件,举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B44,1.2 培养基和培养条件,举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B44,1.3 DNA的提取与纯化1.4 PCR克隆pfkA基因1.5 重组质粒Ku一1的构建及重组菌的筛选和鉴定1.6 重组质粒的稳定性 1.7 磷酸果糖激酶活性测定 1.8 糖转化

11、率和谷氨酸生成比较,举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B44,结果：经基因工程改造后的 B 4 4对糖的转化率有所提高，谷氨酸产量有较大的提高，这主要是增大磷酸果糖激酶剂量，解除了EMP途径中的磷酸果糖激酶的限制，以致解除了磷酸果糖激酶对已经改造的谷氨酸整个代谢途径的限制，故物流代谢增强。以致B44对糖的转化率有所提高，谷氨酸产量有较大的提高。,第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求,国内谷氨酸发酵种子扩大培养普遍采用二级种子培养的流程，即；斜面菌种-一级种子培养-二级种子培养-发酵罐。,第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求,一，菌种的扩大培养,1斜面菌种的培养,第五节 菌种的扩大培养和种子

12、的质量要求,一，菌种的扩大培养,2一级种子培养,第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求,一，菌种的扩大培养,2一级种子培养,第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求,一，菌种的扩大培养,3二级种子培养(1)培养基组成,第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求,一，菌种的扩大培养,3二级种子培养,第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求,一，菌种的扩大培养,3二级种子培养,第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求,二，影响种子质量的因素,1培养基构成：种子培养基要求合有丰富的氮源，足够的生物素，少量的碳源，以利于菌体生长。如果糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生有机酸，使PH降低菌种容易衰老。2温度；幼龄菌

13、对温度变化敏感，应避免温度过高和波动大。3PH值：零小时时PH不宜过高，培养结束PH不宜过低，PH上升后有所下降时，培养时间已接近结束。4溶解氧：长菌阶段对氧要求比发酵时低，溶氧水平过高，抑制长菌。5接种量：种量过少，菌体增长缓慢，适应期长，培养时间长，影响种子活力。但种量过大，在拼瓶操作中易引起污染。一般种且以1左右为宜。6培养时间：培养时间不宜太长，以78h为好，掌握对数生长期作为种子接入发酵罐。,总 结,谷氨酸生产的种子制备,制备过程,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,（1）斜面(AS1.299),培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%，pH 7.0-7.

14、2,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次,（2）一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培 养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基,（3）二级种子(种子罐),培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,（4）种子的质量要求：,108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2时结束，6.887.0-7.2活力旺盛,