A第15章 干细胞.ppt

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1、第十五章 干细胞第一节 概述,一、干细胞的定义和分类干细胞是具有自我更新和产生分化后代两种基本特性的细胞.机体由两类不同的组织和器官构成。一类由体细胞组成,另一类是以生殖细胞为主,包括一些由体细胞组成的组织和器官构成。前者执行机体生命活动的各种生理功能;后者一切为了保证卵巢和辜丸中的卵子和精子的发育和成熟并延续生命。自我更新指干细胞可进行均等分裂,产生两个遗传特性上完全一样的干细胞,均等分裂是大多数细胞的特性,而产生分化后代指干细胞可进行不均等分裂,产生的两个子代细胞中一个仍是干细胞,另一个开始走上分化道路的定向祖细胞。,早期胚胎细胞是全能的,它既可产生体细胞,又能产生生殖细胞,包括从早期的卵

2、裂球和囊胚期的ICM细胞以及后来胚胎的3个胚层已分化后的生殖嵴区的原始生殖细胞.而分化的后代细胞可从包括全能细胞向多能细胞和细胞谱系的各级祖细胞发展,这些细胞仍旧可通过均等和不均等两种分裂方式进行繁殖,一直到最后的终未分化体细胞。干细胞分为两类：一类干细胞包括从早期囊胚ICM(inner cell mass)细胞分离并在体外培养和建系的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)和从胚胎生殖嵴原始生殖细胞(primordial germ cells,PGC)分离建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EGC)；另一类是先在成年组织和器官,以后在胎儿组织被

3、证明其存在,随后个别也在体外培养和建系成功的干细胞,称为组织干细胞(tissue stem cells),又称成体干细胞(adult stem cells)。,二、干细胞(stem cells)与个体发育正常生物个体发育的过程是按严格的时空程序进行的一系列细胞分裂、分化和细胞凋亡相互协调作用的结果。从一个受精卵、全能胚胎干细胞或组织谱系干细胞最终分化为具有独特功能体细胞所组成的组织器官,这一过程通常被称为发育的遗传程序(genetic program),被记录在细胞基因组的结构中.不同物种有不同的遗传程序。在哺乳动物个体发育的不同阶段,包括胚胎、幼年和成年个体的各个发育时期,都存在着发育潜能参

4、差不同的干细胞。干细胞最终演变为独特结构和功能的体细胞或成熟生殖细胞,即细胞分化。从分子水平而言,可以认为细胞分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达,从而控制专一性蛋白质的合成和排布的结果。对正常细胞分化来说,最重要的是多个基因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合,并受不同层次的基因调控网络系统精确无误地调节和控制。,三、胚胎干细胞研究简史从50年代开始,人们就寻找既能在体外增殖,又具有胚胎细胞全能性(totipotency)或多能性(pluripotency),并通过适当条件诱导分化为各种类型分化细胞的模型。50年代末美国发育生物学家Stevens 将着床前发育阶段的小鼠胚胎或12天

5、胚龄的胚胎生殖嵴移植到同系成年小鼠辜丸或肾脏被膜下,移植后7天,发现有80%接种灶出现并发展为畸胎瘤。从中分离、培养和建立了胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cell,EC)系。EC细胞具有恶性生长又具早期胚胎细胞发育多潜能性的双重性质。70年代 EC细胞常用作研究哺乳动物发育遗传以及细胞分化的实验模型,后因EC细胞核型异常,分化细胞类型有限等缺点而不再被使用。80年代初,英国Evans和及美国Martin 2家实验室独立地从小鼠囊胚成功地建立了能在体外不断增殖,并维持不分化状态的多潜能胚胎干(ES)细胞系。90年代初,美国Matsui等从小鼠9天胚胎生殖嵴建立了多潜能的胚

6、胎生殖细胞系。98年美国威斯康星大学Thomson等人利用36枚新鲜或冻存的人工体外受精胚胎,获得人ICM细胞,经体外培养,首次成功建立了5株人类ES细胞系,同年,John Hopkins医学院Shamblott等人从5-9周人流胚胎的生殖嵴和肠系膜首次培养出人EG细胞系。,第二节 胚胎干细胞胚胎干细胞是指早期胚胎的卵裂球、囊胚ICM细胞分离培养和建系的细胞。而从胚胎生殖嵴中PGC分离培养建成的称胚胎生殖细胞。这2类干细胞统称为胚胎性干细胞。一、ES和EG细胞培养、建系技术体外培养建系技术以小鼠的最为成熟,基本原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统。由于

7、早期胚胎细胞离体后极易发生分化,首先要解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性问题。目前常用的细胞分化抑制物有3种：饲养层细胞(feeder layer cells)、特殊细胞的条件培液(conditioned medium),如BRL(Buffalo rat liver)细胞条件培液,分化抑制因子(differentiation inhibitory factor,DIF),如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)。此外,也有添加通过gp130信号转导途径的细胞因子,如白介素6(lL一6)、Oncostatin M和睫状神经营养因子(ciliary n

8、eurotrophic factor,CNTF)等同样可维持小鼠ES细胞的不分化.,体外培养ES和EG细胞可划分为两大类：饲养层培养法和无饲养层培养法。(一)饲养层细胞培养法不论ES细胞或EG细胞,原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞.不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同。但都要求在ES或EG细胞培养过程中的饲养层细胞保持不分裂增殖,而仍然保持细胞的代谢活性。常用的饲养层细胞有下列两种:一种是取自各种品系小鼠交配后12 dpc(days post coitum)的胚胎成纤维细胞(embryonic fibroblast,MEF)。经丝裂霉

9、素C(mitomycin C)处理以终止细胞分裂后,用作ES细胞培养的饲养层。另一种是来自SIM小鼠(S)胚胎的对硫代鸟嘌岭(thioguanine,T)和乌本苷(ouabain,O)有抗性的成纤维STO细胞系,主要分泌干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)和白血病抑制因子(LIF)。,(二)无饲养层培养法以添加某些特定细胞的条件培养液和LIF生长因子至含胎牛血清(FCS)的正常培养液,替代饲养层细胞。有3种条件培养液可用于小鼠ES细胞培养：直接在ES细胞基础培养液中加入重组生长因子和LIF等。Buffalo大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)。2-3周龄幼年大鼠心肌细胞条

10、件培养液(RH-CM)。一般以2-3份上述细胞条件培养液加1-2份新鲜的ES细胞培养液,再添加10%-20%胎牛血清,共同组合成无饲养层的ES 细胞培养系统。但在胚胎干细胞原代和建系初期缺乏饲养层时,用这种条件培养液培养ES和EG细胞成功率不高。,(三)ES和EC细胞的体外培养1.ES细胞不同动物,甚至同种不同品系动物的胚胎发育速度和方式存在着较大差异,如猪ICM细胞生长与 小鼠不一样,生长速率慢,且有一个休眠(quiescent)期。因此,ES细胞培养建系需根据各个物种而选择不同发育阶段的早期胚胎。如一般小鼠多选用3-4 d的囊胚或2-3 d的桑椹胚,猪取8-10 d 的囊胚,绵羊取8-9

11、d的囊胚,人和牛取7-8 d的囊胚。同时,经体外受精的胚胎或由核移植获得的重构胚胎在体外培养至所需适当的发育阶段也是选取ES细胞培养的有效材料来源。基本培养液为含15%-20%FCS、0.1 mmol/L-疏基乙醇和50IV/mL青霉素、50g/mL链霉素的DMEM液.将桑椹胚或囊胚接种于预先铺有作为饲养层而无有丝分裂活性的单层MEF细胞的35 mm培养皿中。培养2-3天后按下列方法之一分离出ICM细胞进一步培养.,方法一：免疫手术法(immunosurgery).由于4-4.5 dpc的小鼠囊胚由己分化的滋养外胚层(trophectoderm)和未分化的ICM细胞组成,前者细胞表面一般已表达

12、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC),能识别其相应抗体和形成免疫复合物,在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解.囊胚去除透明带,直接暴露于稀释的兔抗JCR小鼠脾细胞抗血清(抗H-2b)。再移到新鲜豚鼠血清中,囊胚的滋养外胚层细胞呈泡状,发生免疫溶解;而ICM细胞不具H-2b抗原,不发生免疫溶解,故细胞完整元损。ICM细胞经Hanks液洗涤后,移至96孔铺有MEF或STO饲养层细胞和DMEM基本培液的板内进一步培养。,方法二:常规培养桑椹胚或囊胚在铺有MEF饲养层的DMEM基本培养液中,未去透明带的桑椹胚或囊胚培养3-4 d,ICM细胞团从

13、贴壁的囊胚内长出来。吸出ICM细胞团,用0.25%(m/V)胰蛋白酶(trypsin)和0.2 mmol/L EDTA混合消化液在370C消化5 min.部分解离的细胞团移至铺有MEF饲养层的24孔培养板,ICM细胞首先出现贴壁生长,继续培养4 d,可在一些孔内见到巢状集落生长的ES细胞团.用胰蛋白酶消化巢状ES细胞团,并继续培养,一般4-5 d间隔用胰蛋白酶消化,克隆和纯化ES细胞,视ES细胞密度逐渐转移到较大容积的培养皿或培养瓶。ES细胞在培养过程中,有时在巢状干细胞团周边出现少量分化细胞,这时除了需继续维持饲养层细胞外,在培液中再添加适量的LIF生长因子,可克服细胞进一步分化的现象。,E

14、S细胞常用培养基的添加物除胎牛和小牛血清外,主要有多种生长因子,例如表皮生长因子(ECF),可促进细胞DNA合成和 mRNA转录,使细胞周期的S期提前,周期缩短;胰岛素样生长因子(ICF)对ICM细胞有促进增殖作用;干细胞生长因子(SCF)对干细胞有调控和促分裂作用,同时可抑制细胞凋亡。此外,在培液中还需添加还原剂-巯基乙醇,可使血清中的含硫化合物还原成谷胱甘肽,以消除ES细胞培养过程中产生的毒性过氧化物,同时,-巯基乙醇有诱导细胞增殖和促进胚胎细胞贴壁作用。2.EG细胞PGC取材根据其在不同物种的早期胚胎中所处迁移位置而定。小鼠EG细胞建系基本过程如下：收集8.5-10.5 dpc小鼠胚胎,

15、在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞(PGC)的生殖嵴组织,以0.02%EDTA液孵育含PGC细胞的生殖嵴组织,37 0C,15 min.吸管轻吹打散,接种于铺有MEF或STO饲养层细胞的4孔培养板内。接种细胞首先出现贴壁生长,每天或隔天更换培养液。,生殖嵴组织培养物在饲养层细胞上分裂增殖,4-6 d后在显微镜下将包含原始生殖细胞的细胞团用胰蛋白酶消化并转移至新的饲养层细胞上,继续培养增殖。重复用胰蛋白酶消化并移至新的饲养层细胞,经过同上2-3次过程,可产生巢状(nests)生长的干细胞集落。最后将它转移到铺有饲养层细胞的培养瓶内进一步扩增。EG细胞的饲养层常用STO细胞,培养液基本同ES细胞

16、,但除LIF外还要添加干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。二、ES和EG细胞系基本特性(一)体外能无限增殖建系后的ES细胞在体外培养不仅能存活,还能无限增殖,是干细胞自我更新特性在体外培养中的延续。但实际上,传代次数愈多,ES细胞会像常规细胞一样,出现核型不正常的情况,并失去了ES细胞原有的一些重要特性。,129品系小鼠的ICM细胞非常容易建立ES细胞系,而其他品系的小鼠不容易,说明遗传因素制约ES细胞建系。(二)体外产生分化细胞产生分化细胞是干细胞基本特性在体外培养中的延续。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,因此,ES和EG细胞体外培养的首要条件是建立适合其增殖、抑制

17、其分化、确保维持其多能性的培养体系。ICM细胞一般接种于铺有灭活的小鼠MEF细胞作为饲养层的琼脂平板上,加有含抑制分化的LIF的培养液,或再添加适当的分化诱导物质(如维甲酸等),或通过悬滴培养成拟胚体(embryoid bodies,EB)等,易分化产生包括3个胚层的各种类型的分化细胞,常见的是几种类型细胞混在一起,单一类型细胞要靠定向诱导分化.体外培养的ES细胞也能产生雌、雄两性的生殖细胞,实现了体外培养的ES细胞也能表达全能性(totipotency)概念,(三)体内产生畸胎瘤ES和EG细胞若接种于免疫缺损小鼠(裸鼠或SCID小鼠)腋窝下,或接种于同种同基因小鼠的皮下、眼窝和器官包膜下,均

18、可形成由内胚层、中胚层和外胚层多种类型细胞构成的畸胎瘤。后者通过组织学检查,可以用作分析和鉴定ES或EG细胞的发育多潜能性,判断所产生分化细胞种类的多寡。(四)巢状生长有多能胚胎干细胞分子标记ES和EG细胞在体外彼此呈现单层或多层紧密堆积,而形成岛状或巢状集落群体的生长形态。将这种岛状或巢状群体细胞的克隆挑出,用胰蛋白酶轻度消化后接种于新的饲养层或特定的条件培养液中,继续培养3-4天后,分散的ES细胞或EG细胞又重新长出彼此紧密接触的岛状或巢状群体细胞克隆。巢状集落生长是ES和EG细胞最具特征性的生长方式。不同动物ES和EG细胞巢状集落有所不同.如猪EG细胞集落常是圆的,比小鼠ES和EG细胞集

19、落较扁平和较不透明.,小鼠、猪和人类等灵长类动物的ES和EG细胞都具有特征性的多能胚胎干细胞的分子标记,表19.2.除牛的ES细胞不表达碱性磷酸酶(AKP)活性外,其他动物和人的ES或EG细胞都表达AKP的活性。分化的ES或EG细胞都不表达AKP。因此,AKP活性可作为ES或EG细胞是否分化的重要标记之一。胚胎发育阶段特异性抗原(stage specific embryonic antigen,SSEA)是早期胚胎细胞表面的一类糖蛋白,不同种类的SSEA因糖基化不同而区分为SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4不同的表位分子。未分化的早期胚胎细胞 SSEA呈阳性,而分化的细胞为阴性。人和灵长

20、类ES细胞表达SSEA-3和SSEA-4,而SSEA-1仅在人EG 细胞及刚开始分化的ES细胞中表达。小鼠的ES和EG细胞只表达SSE A-1.,肿瘤相关抗原(tumor related antigen,TRA)是一种对唾液酸酶敏感的细胞表面糖蛋白,生殖细胞肿瘤标记(germ cell tumor marker,GCTM)是另一类抗原决定簇不同于TRA的细胞表面糖蛋白。人及猴的ES细胞与TRA-1-60、TRA-1-80和GCTM-2抗体均可起反应。人与猴是近亲,因此,人与猴的ES细胞都表达 TRA分子,而啮齿动物小鼠却缺(见表19.2),推测TRA可能是灵长类多能胚胎干细胞特异性的分子标记。

21、Oct-4是生殖系专一性转录因子,在小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及体外培养的多能胚胎干细胞中特异地表达,被认为是全能和多能性的一种标志基因。小鼠、猪和包括人类在内的灵长类动物的ES和 EG细胞都表达Oct-4。(五)染色体数目和核型正常无论是小鼠或人的ES和EG细胞,经体外传代培养后,具有正常的染色体数目和二倍体核型,即使冻存复苏后应仍然保持这种特性.新建立的ES细胞系常有不正常的核型,因此,需对新建系的ES细胞进行染色体数目和核型进行分析确认。,(六)遗传可操作性ES细胞遗传操作的可行性是由于ES细胞在体外可以不断地自我增殖,又是具有发育的全能或多能性,并能通过构建嵌合体而产生有功能的生

22、殖细胞。这为通过基因工程途径改造物种提供了独特的、无与伦比的受体细胞。ES细胞遗传操作主要有2类方法：一是通过同源重组技术去剔除ES细胞基因组的一个目的基因,所谓基因剔除(knock out);二是转染一个外源基因定点整合到ES细胞基因组的正确位置,所谓基因定点敲入(knock in)技术。(七)形成嵌合体实现种系传递参与嵌合体实现种系传递是ES细胞生物学的重要概念。只有通过形成嵌合体实现种系传递即要分析干细胞是否能参与形成生殖腺中卵子和精子才能鉴定体外培养建系的ES和 EG细胞是否具有全能性。,三、ES和EG细胞定向诱导分化(一)基本原理细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调

23、的分子细胞学过程。早在20世纪六七十年代前,实验胚胎学家就发现蛙类早期原肠胚(gastrula)的背唇(dorsal lip)背方区域能够诱导外胚层分化为神经管,而靠近腹侧面则诱导出尾部结构。接着又发现胚胎发育中组织发生和身体构造形成是一连串的诱导连锁过程,如神经组织听囊形成后,则诱导邻近的间质细胞形成软骨囊;水晶体则剌激覆盖的外胚层诱导出角膜.在体胚胎细胞分化过程中,诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性,同时也决定于被诱导细胞的反应能力(competence),后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制。,ES细胞是体外研究诱导分化的较理想的模型。在胚胎细胞被诱导分化中,所用诱导物

24、质种类繁多,大致分两类:一类是使被诱导细胞可逆性地轻度损伤:例如无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物、氨水甚至蒸馏水或缺钙的盐水,都能使两栖类胚胎细胞渗透压改变致成轻度损伤,导致神经细胞分化。另一类诱导物,如类固醇激素、维甲酸衍生物(RA等),多肽生长因子(bFGF、TGF、Activin)等,则是通过与被诱导细胞表面各自的受体结合而介导的细胞诱导分化。同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造。ES和EG细胞定向诱导分化是当前ES细胞生物学研究中的热点之一。,(二)定向诱导分化的类型体外定向诱导分化可分为谱系分化(lineage differentiation)和定向分化(comm

25、itted differentiation)。谱系分化包括ES细胞经谱系祖细胞(lineage progenitors)、谱系定型细胞(lineage committed cell)到终末分化细胞的整个细胞分化的全过程。在这过程中,会出现一些不稳定的、过渡型的前体细胞。由于ES细胞也是一种具有不受约束的和无序的自我发育特性,ES细胞在体外被诱导时常同时出现不同胚层类型的多种分化细胞,这增加了识别谱系祖细胞和谱系定型细胞的困难性。定向分化要设法控制ES细胞导向产生单一类型的终末分化细胞,这是当今临床细胞移植或细胞治疗迫切需要的。对ES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因或有关细胞分化因子等遗传操

26、作,并结合报道基因和添加特定细胞因子诱导条件选择等手段,可能是探索ES细胞定向诱导分化的一条有效途径。,(三)ES细胞体外诱导分化的基本途径1.单层ES细胞培养和诱导分化单层ES细胞在撤除LIF并添加适当浓度的细胞分化诱导剂,如维甲酸(retinoic acid,RA),二甲亚矾(DMSO)和环六亚甲基双乙酰胶(HMBA)等并添加适当的生长因子条件下,每隔2天,更换含诱导剂的新鲜培养液。细胞分化类型随诱导剂和生长因子性质及其浓度,细胞浓度,培养条件等因素,特别是ES细胞本身的分化潜能和特性而异。通常单层培养的ES细胞较难分化为单一类型的细胞,常出现以某种类型分化细胞为优势的情况下,杂有一些其他

27、类型的分化细胞。2.ES细胞拟胚体形成和诱导分化形成拟胚体方式是ES细胞定向诱导分化的常用途径.有两类方法,(1)软琼脂培养ES细胞经胰蛋白酶消化,吹打成单个细胞,接种于预先以软琼脂铺底的培养皿内,ES细胞呈悬浮生长,增殖,彼此粘附聚集而形成拟胚体。(2)悬滴培养ES细胞经胰蛋白酶消化,制备成单个细胞悬浮液,滴种在直径为10 cm培养皿的盖子上,制成许多悬浮细胞小滴,培养皿内加入适量PHS,然后小心盖上带有许多小滴的盖子,使盖子上的许多小滴倒置成悬滴。置370C,5%CO2培养箱。培养3天后,悬滴中的ES细胞聚集形成拟胚体。将拟胚体移至含细胞分化诱导剂(如RA)的培养皿或微孔板进一步培养。然后

28、移放人铺有 0.1%白明胶的培养皿或微孔板内,在含有或不含细胞分化诱导剂,并缺乏LIF的培养液中进一步培养,可被诱导分化为不同类型的细胞.,(四)ES细胞体外诱导分化的几种细胞人类ES/EG细胞建系成功,人们借鉴小鼠ES细胞体外诱导分化的成功经验,致力于将人ES 细胞改造成以临床基因、细胞治疗和组织工程种子细胞为目的的各种定向诱导分化细胞研究.目前至少有20余种从ES细胞诱导分化来的体细胞获得成功(表19.3)造血细胞(hematopoitic cell)是报道最多的一种分化细胞类型。小鼠ES细胞拟胚体在体外可分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构,分化产生红细胞、髓细胞和淋巴细胞等各种造血系

29、统的细胞。一般常采用分阶段诱导小鼠ES细胞分化为造血干细胞和B淋巴细胞:首先使ES细胞发育成拟胚体,然后,用胰蛋白酶消化成单个细胞,经干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和胚胎细胞的条件培养液处理,使其定向分化为造血干细胞;再用原代骨髓基质细胞作饲养层和SCF及IL-6细胞因子处理,可进一步使ES细胞来源的造血干细胞分化为B淋巴细胞系。,在体胚胎研究表明,7.5 d的小鼠胚胎最初在卵黄囊(yolk sac)内出现大而有核的前成红细胞。当胚胎长至10-12 d肝形成时,则卵黄囊前成红细胞逐渐消失。表明胚胎造血器官是从卵黄囊转移到胚胎肝脏的。而在ES细胞体外分化实验中,生长4d的拟胚体首先

30、出现前成红细胞,拟胚体生长至第10-12 d时前成红细胞逐渐消失。成熟红细胞和成髓细胞都是在前成红细胞出现后不久才产生。利用骨髓基质细胞或其条件培养液,可以诱导小鼠ES细胞在体外分化为造血干细胞。小鼠在体胚胎的卵黄囊血岛内,前成红细胞的产生总是伴随着内皮细胞的出现,因而认为内皮细胞和前成红细胞来源于共同的祖细胞。同样,ES细胞体外分化时,拟胚体的血岛样结构中前成红细胞集落周围也有内皮细胞出现。ES细胞衍生的拟胚体分化的管状结构是由内皮细胞排列组成的,管道内还含有一些造血细胞,类似于胚胎发育中的早期血管发生。将ES细胞单层培养在含重组TGF1的I型胶原蛋白为基质的三维系统内,或将过度表达TGF1

31、的ES细胞单层培养在I型胶原蛋白为基质的三维系统内都能获得内皮细胞组成的血管样结构,而缺乏重组TGF1处理或无过度表达TGF1的正常ES细胞在I型胶原蛋白为基质的三维系统内培养,不形成血管样结构.因此,TGF1可能是通过细胞外基质行使其形成血管的功能.,单层培养的小鼠ES细胞的诱导分化实验中,在10mol/L维甲酸(RA)与1 mmol/L双丁酰基环腺苷磷酸(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate,dBcAMP)共同作用下,90%-95%的分化细胞为神经胶质细胞。小鼠ES细胞也可在体外被诱导分化为少突神经胶质细胞(oligodendrocytes)和运

32、动神经元。ES细胞拟胚体在特定条件贴壁培养时也能被诱导分化为神经元。用悬浮培养4 d的拟胚体在含RA的培养液中继续培养 4 d,再使拟胚体贴壁培养则可高效重复地分化出神经细胞,不仅表达专一性的神经微丝M和微管蛋白,还有钠、钾、钙等离子信号通道的特征。分化的神经细胞还表达神经递质GABA、glycine和受体NMDA等不同物质。甚至在体外诱导分化早期的拟胚体中检测到神经元和神经胶质细胞的共同前体细胞的专一性标志巢蛋白(nestin)。用RA诱导ES细胞分化为表达-氨基丁酸的神经细胞植入Huntingtons病(一种遗传性舞蹈病)大鼠模型体内,具有神经细胞功能的移植物使患鼠症状有所改善,并存活了6

33、周。因此,ES细胞体外诱导分化细胞有可能成为临床细胞治疗的移植物来源的新途径之一。,悬浮或悬滴培养的小鼠ES细胞的拟胚体在RA诱导条件下贴壁生长数天,常出现某些分化细胞集落具节律性自发收缩现象.电镜观察证实,收缩的细胞内存在着肌原纤维、肌小节和闰盘等典型心肌细胞特有结构。发现心肌细胞分化过程中,分化细胞团刚开始收缩时型肌球蛋白重链(MHC)表达占优势,继续培养数天,则型MHC逐渐占优势,最终在分化的心肌细胞中,27%表达型MHC,33%同时表达和型MHC,40%表达型MHC。这种MHC亚型的转变与在体胚胎心肌发育过程极相似。除心肌细胞外,决定骨骼肌发育的基因myf-5、myogenin,myo

34、D等在ES细胞拟胚体的分化细胞中都能够表达,而且表达时序与在体胚胎发育中相同。ES细胞拟胚体贴壁培养1-2周后一般都能出现肌细胞,继续培养则融合成肌管,显示出骨略肌发育的典型特征。分化的肌细胞常表达成熟肌细胞专一的Ca2+信号通道和烟碱受体(nicotinic receptor)。二甲亚矾诱导ES细胞拟胚体可形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多种类型肌细胞,用肌肉专一性的调节因子myoD基因转染ES细胞并结合DMSO诱导处理,额外表达myoD基因的ES细胞,则主要分化为骨骼肌,没有心肌和平滑肌类型细胞出现,且骨骼肌常融合形成肌管。因此,通过改造ES细胞某种基因和给予适当培养条件的途径,是诱导ES细胞向

35、特定单一类型细胞分化的可行方法之一。,小鼠ES细胞或EG细胞通过悬滴培养法,形成的拟胚体被转移到铺有琼脂的培养皿中,悬浮培养3 d,每天更换含有诱导剂二甲亚矾(DMSO)的培养液。3 d后,经过诱导剂处理的拟胚体移人表面事先用明胶(gelatin)包被的培养皿中进一步贴壁培养。这时给培养液中加入胰岛素、三腆甲腺原氨酸(triiodothyronine)和胎牛血清,10-15 d后大部分拟胚体分化为脂肪细胞。脂肪细胞中的脂滴含有甘油三酯(triglycerides),很容易用油红O(oil red O)染色鉴定,显示特异性红色。小鼠ES细胞通过形成拟胚体并结合添加转化生长因子家族(如TGF1,B

36、MP-2和BMP-4)可诱导分化为表达软骨相关基因和蛋白的软骨细胞。ROSA-geo基因转染的小鼠ES细胞,在缺乏G418的情况下聚集成拟胚体。用10%小牛血清代替胎牛血清,培养液中含有分化诱导剂1mol/L地塞米松(dexamethasone),2-3 d更换培养液,50 d后,这种拟胚体发育成软骨细胞,经Alcian blue液染色,显示出明确的软骨细胞特征,细胞间存在着11型胶原。,小鼠ES细胞经过拟胚体阶段,结合无血清和多种生长因子、有丝分裂原处理,可被诱导分化为分泌胰岛素的、类似胰岛的结构。近来利用人ES细胞经过悬浮培养获得胚体,再经如bFGF等生长因子诱导可分化为以产生胰岛素为特征

37、的胰岛样细胞。ES细胞定向诱导分化为肝细胞。用RA、肝细胞生长因子(HGF)、-神经生长因子(-NGF)共同添加至细胞培养液,被诱导分化细胞从形态学、生化和肝细胞功能性标记等指标都证明是具有功能性的肝细胞。但仅使用RA,虽能分化为上皮样细胞,可并不表达各种肝功能的生化指标,例如,白蛋白、AFP、G-6-P、1-AT、肝核因子-4和SAPK/ERK激酶-1(SEK1)等,表明 HGF和-NGF是诱导小鼠ES细胞分化为功能性肝细胞的重要因子。,第三节 成体干细胞20世纪初,Pappenheim根据对骨髓中的造血细胞发生过程的形态学观察,提出了骨髓中存在着未分化干细胞的设想,认为未分化的干细胞通过各

38、个中间阶段的前体细胞最终生成成熟的多种类型血细胞。首次提出了成体干细胞(adult stem cell)的概念。成体干细胞是一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新潜能并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞的干细胞,故又名组织干细胞。成体组织中存在干细胞是个体发育进化史的产物,涉及组织器官的再生能力和创伤修复等基本特性。如骨髓组织的造血干细胞可分裂、分化为血液系统的各种细胞,定期补充细胞成分或失血。小肠和皮肤中的干细胞也分别能分化、补充和更新小肠和皮肤组织的一些细胞。,传统的观点认为,干细胞一旦分化成熟,就不再分裂增殖了;人体除了血液、皮肤、消化管上皮和肝脏的组织干细胞有一定的再生能力外,

39、其他组织器官如神经组织基本上不再具有再生能力.同时也认为在成体中存在的属于某组织器官的成体干细胞是专能或限能的,如造血干细胞只能分化为血液系统的各种细胞等.新近的研究表明,这些成体干细胞的发育潜能可跨越组织或胚层的界限。如从成年小鼠脑组织分离的神经干细胞移植入经X射线照射过的小鼠骨髓部位,则分化出血液细胞。此后,发现人和小鼠的神经干细胞具有分化为肌细胞和胚胎多种组织细胞的潜能.因此,神经干细胞同样具有可塑性,能分化为非神经类型的细胞.人们把成体干细胞具有跨越组织或胚层分化的这一特性称为干细胞的可塑性(plasticity)或跨越分化(transdifferentiation).,成体干细胞分化

40、的多能性表明：细胞的命运不是一成不变的,这为许多疾病的细胞治疗提供了新的思路和有希望的前景。成体干细胞是一种处于尚未终末分化的、处于干/祖或前体细胞状态的成体细胞,它来源于成年和未成年个体的组织干细胞。在正常生理条件下,倾向于分化成并更新所在组织的各种细胞。但在特定的外界条件诱导下,一种组织的成体干细胞能超越该特定组织、胚层分化成其他组织的功能性细胞,补充参与其他组织损伤的修复等。一、成体干细胞具分化可塑性成体干细胞具有可塑性(plasticity).证据大多数来自小鼠的实验,人们确信机体中成体干细胞的可塑性现象具有普遍性。,(一)骨髓干细胞骨髓是由不同类型多种细胞成分组成的组织,除了分化的血

41、细胞和间质细胞外,有二类成体干细胞：一类是造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC),能生成各种血细胞;另一类是间质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),能生成内皮细胞、脂肪细胞和成纤维细胞等。通过全骨髓移植实验证明,骨髓中的细胞在不同微环境的位点,除形成各种血细胞和衍生于间质干细胞的各类细胞外,还可被诱导分化为神经细胞、肌细胞、骨和肝细胞等外、中、内3个胚层的不同类型的分化细胞(表19.4)。证明骨髓组织中含有的干细胞具有多潜能性,在特定的条件下可跨越组织或胚层分化的能力,能够分化为内皮、神经元、胶质细胞和肝细胞等。目前已知骨髓中存在造血干细

42、胞(HSC)和间质干细胞(MSC)两类干细胞,为区别这两类干细胞在分化潜能上的不同,便把骨髓干细胞分离和纯化。体外培养的骨髓细胞,HSC细胞呈悬浮集落生长;而MSC细胞则贴壁生长。两者都具有多潜能性。,1.间质干细胞MSC细胞在体外单独培养,证明具有分化为包括骨细胞、软骨细胞、腱、脂肪细胞和肌细胞等潜能,也能分化成内皮细胞和内胚层的肝细胞。MSC细胞移植至脑中,可分化为非间质细胞性质的神经细胞。当MSC细胞注射入早期囊胚,然后移植入假孕母鼠,分析嵌合体动物,发现MSC细胞可参与大多数体细胞类型的分化;当MSC细胞移植入正常宿主时,则除了肝、肺和肠的上皮外,主要分化为造血细胞的谱系世代。当MSC

43、细胞移植入小量射线照射的宿主,则造血系统和胃肠道组织有所增加。2.造血干细胞HSC细胞是研究得最早和最多的一种异质性很强的干细胞。已知HSC细胞表面存在着一些标志,可用流式细胞仪或免疫磁性分选技术从骨髓细胞中分离和纯化出HSC细胞。经移植至不同的体内微环境,可分化为三胚层的各种类型细胞,包括心肌、骨骼肌、血管内皮系统,肝细胞、肺泡、食管、肠 道、胃、胆管以及皮肤和神经细胞等。因此,骨髓中的HSC与MSC一样,分化潜能具有很大的可塑性,可分化为跨越胚层的各种类型细胞。,(二)神经干细胞神经发育过程中未成熟的、增殖中的各类细胞称为神经前体细胞(progenitor cell).神经干细胞是神经系统

44、中一类能自我更新并产生神经元和神经胶质细胞的前体细胞.早期研究确证胚胎的神经系统中普遍存在着这类神经干细胞.其后,进行成体神经干细胞分离,发现成体神经干细胞主要存在中枢神经系统的2个神经发生区域：即脑的海马区(hippocampus)和次脑窒区(subventricular zone,SVZ)以及包括脊髓等其他一些非神经性的区域.神经干细胞或神经前体细胞在个体发育过程中,经受发育上的时空变化,成体神经干细胞的可塑性受到限制。通过个体不同发育阶段的神经干细胞移植至宿主不同部位,发现神经干细胞移植物分化为神经细胞的潜能具有发育阶段的依赖性,成体中的神经干细胞分化潜能随发育遂受到限制。,用成体中枢神

45、经系统的干细胞经体外培养扩增的移植实验表明,其在成体微环境中尚有一定的可塑性。如成体脊髓衍生的干细胞通常不产生神经元,若注人成体脑的海马区,则能产生神经元;成年海马衍生的干细胞移植入SVZ,则能产生嗅球神经元。然而,至今却没有直接证据表明成体神经干细胞分化为如在胚胎中正常产生的有突触的神经元。研究表明,把体外培养的SVZ干细胞生长成神经球通过注射入鸡胚神经嵴(neural crest)途径,其分化潜能有所扩大,可产生周围神经系统。另外,神经干细胞的子代也有可能恢复发育多潜能性。如通常唯一产生神经胶质细胞的视神经O2A中枢前体细胞在体外可恢复其多能的、产生中枢神经系统的干细胞。表明环境因子能改变

46、神经干细胞的命运或增加其可塑性。,(三)肝干细胞由于肝干细胞本身缺乏特异性标志,给肝干细胞分离和鉴定带来了困难。早在58年,Wilson JW等人认为“肝组织中存在着干细胞”,依据是肝组织因营养损伤或部分切除时仍能再生,但已存在的肝细胞不能分裂和再生,新生的肝细胞只能来源于肝干细胞。化学致癌实验时,位于门管周围的小细胞发生增殖,这种具有卵圆形细胞核、少细胞质的细胞称为卵圆形细胞(oval cell)。在人肝组织中,同样发现这种卵圆形细胞。对发育中的肝具有自我更新能力的细胞进行单克隆培养和分析,证明这种卵圆形细胞在体外能大量增殖,细胞移植后在形态和功能上可分别分化为肝细胞和胆管上皮细胞,表明肝卵

47、圆形细胞是肝干细胞.近来发现,骨髓和血液中的细胞能分化为肝细胞.肝干细胞来源可能有两条途径：一是肝组织外,骨髓和血液是卵圆形细胞的来源,人的骨髓细胞也能分化为肝细胞和胆管上皮细胞;二是肝组织内处于休眠期的肝干细胞。双潜能的肝干细胞同时表达肝细胞和胆上皮细胞的标志物,细胞角蛋白CK7 和CK19为胆上皮细胞的特异性标志;白蛋白和肝代谢酶细胞色素P450可作为肝细胞的特异性标志物;而细胞角蛋白CK8和CK18在肝实质细胞和胆上皮细胞都有表达。,肝干细胞一般除了其特有的形态学外,常结合上述特有标志通过免疫组织化学、流式细胞检测和原位杂交等方法予以鉴定。双潜能卵圆形细胞不仅能分化为肝细胞和胆管上皮细胞

48、,当分别移植到胰腺和十二指肠时,还能跨越组织各自分化为胰腺细胞和肠上皮细胞。表明肝干细胞在适当的微环境能被诱导分化为内胚层其他组织的细胞.卵圆形细胞异常分化或分化突然停止有可能发生肝细胞癌。在培养液添加适当的分化诱导剂,如丁酸钠或二甲基亚矾,可诱导和促进肝干细胞分化为肝细胞。在培养液中添加转化生长因子(TGF)或肝细胞生长因子(HGF),可诱导肝干细胞分化为胆管上皮细胞。,(四)骨骼肌干细胞肌肉的生长、更新和修复是与肌纤维周围的卫星细胞(satellite cells)有关,一般认为这就是骨骼肌干细胞。从肌肉分离的干细胞不仅能分化出肌肉,还能产生血液细胞成分.Jiang等人从3天龄的新生小鼠前

49、后肢近端分离和体外培养骨骼肌细胞,得到一类多能成年前体细胞(multipotent adult progenitor cells,MAPC)的细胞。这种细胞具有类似于小鼠骨髓MAPC的表型和特征,能在体外增殖。肌肉来源的MAPC在体外特定的细胞因子条件下可被诱导分化成内皮、肝细胞样细胞和包括进一步分化为神经元及神经胶质样细胞的神经外胚层细胞。表明骨骼肌组织中确实存在着干细胞,并具有分化的可塑性。,二、成体干细胞研究中的问题(一)异质性成体干细胞在组织中的含量极少,又缺乏特异性检测标志,很难从组织中将其分离纯化出来。在一些成体干细胞“可塑性”的实验中,人们质疑所谓“可塑性”可能是组织中混杂着几种

50、或一群不同类型的干细胞而分化的结果,这在骨髓组织的干细胞实验中更为明显。在肝细胞谱系分化的各类祖细胞中,就发现存在着异质性(heterogeneity)和可塑性。干细胞的异质性在遗传学中是指由于不同遗传机制而产生相同或类似的表型。异质性在某种程度上是干细胞固有的特性。造血干细胞异质性早已被证明。从骨骼肌干细胞的研究中发现,这类所谓的肌干细胞在特定环境下分别分化出肌肉和血细胞,其实这是由含有两类分化方向完全不同的干细胞所致。,(二)干细胞所处的环境小鼠造血干细胞和胰腺干细胞都能分化出肝细胞并能修复小鼠受损的肝组织。但是,移植造血干细胞和胰腺干细胞对修复小鼠受损肝组织的效果远远不如移植成熟肝细胞本