【教学课件】第十章发酵工程下游工艺.ppt

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1、微生物工程与设备,湖师院生科院,第十章 微生物工程下游工艺,第十章 微生物工程下游工艺,第一节 微生物工程下游加工工程概论,一、微生物工程下游加工工程的特点和重要性,从微生物发酵的发酵液、酶反应的反应液或动植物细胞培养的培养液中分离、精制有关产品的过程。,1、定义,它是由化学工程的几个单元操作组成，但由于生物物质的特性，有其特殊要求，而且其中某些单元操作在一般化学工业中应用较少。,第一节 微生物工程下游加工工程概论,一、微生物工程下游加工工程的特点和重要性,2、特点,所提取的代谢产物在培养液（发酵液）中浓度很低，且稳定性差，对热、酸、碱、有机试剂、机械剪切力等十分敏感，易失活或分解。培养液中杂

2、质含量高，特别是利用基因工程方法产生的蛋白质常伴有大量性质相近的杂蛋白质。发酵液是复杂的多相系统，含有细胞、代谢产物和未用完的培养基等。分散在其中的固体和胶状物质，具可压缩性，其密度又和液体相近，加上粘度很大，属非牛顿性液体，使从培养液中分离固体很困难。,第一节 微生物工程下游加工工程概论,一、微生物工程下游加工工程的特点和重要性,2、特点,下游加工工程的代价昂贵，且回收率不是很高。,传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸)，分离和精制部份占整个工厂投资费用的 60%。对重组DNA发酵、精制蛋白质的费用可占整个生产费用的80%90%。,第一节 微生物工程下游加工工程概论,二、微生物工程下游加工工

3、程的基本原理,一些单元操作原理,第一节 微生物工程下游加工工程概论,二、微生物工程下游加工工程的基本原理,一些单元操作原理,第一节 微生物工程下游加工工程概论,三、微生物工程下游加工工程的一般程序,1、下游加工工程的一般工艺程序,按生产过程的顺序分为四大框架步骤：发酵液的预处理和过滤 提取 精制 成品加工,第一节 微生物工程下游加工工程概论,三、微生物工程下游加工工程的一般程序,1、下游加工工程的一般工艺程序,第一节 微生物工程下游加工工程概论,三、微生物工程下游加工工程的一般程序,2、工艺程序的划分,预处理和过滤：除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质。初步纯化：除去与产物性质差异较大的杂质

4、，为后序精制工序创造有利条件。高度纯化：除去与产物的物理化学性质比较接近的杂质。成品加工：成品形式由产品的最终用途决定。,第一节 微生物工程下游加工工程概论,三、微生物工程下游加工工程的一般程序,3、选择下游加工工序的原则,是胞内产物还是胞外产物 原料中产物和主要杂质浓度 产物和主要杂质的物理化学特性及差异 产品用途和质量标准 产品的市场价格 废液的处理方法等,第二节 发酵液的预处理和过滤,一、预处理的目的和要求,目的 分离菌体，将发酵液中的杂质除去，改变滤液性质以利于提取和精制后续各工序顺利进行。,2.要求 菌体的分离；固体悬浮物的去除；蛋白质的去除；重金属离子的去除；色素、热原质、毒性物质

5、等有机杂质的去除；改变发酵液性质。,第二节 发酵液的预处理和过滤,二、预处理的方法,采用理化方法设法增大悬浮液中固体粒子的大小、或降低粘度，以利于过滤。去除会影响后续提取的高价无机离子。,1、高价无机离子的去除方法钙离子，可用草酸。草酸溶解度较小，用量大时，可用其可溶性盐，如草酸钠。反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液质量。但草酸价格较贵，应注意回收。如四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，在60下反应生成草酸铅。后者在9095下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。镁离子，可用三聚磷酸钠。它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸

6、的提取。铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。,第二节 发酵液的预处理和过滤,二、预处理的方法,2、可溶性杂蛋白质的去除方法 等电点沉淀法：等电点状态，蛋白质溶解度最低 加热处理：蛋白质变性，溶解度降低 吸附作用:用凝胶吸附蛋白质 有机溶剂、金属离子等沉淀蛋白质,第二节 发酵液的预处理和过滤,3、发酵液的凝聚和絮凝,二、预处理的方法,凝聚：是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。,絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶体聚集形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。,机理：电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电

7、斥力，使范德华力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子，或在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。,第二节 发酵液的预处理和过滤,3、发酵液的凝聚和絮凝,二、预处理的方法,第二节 发酵液的预处理和过滤,3、发酵液的凝聚和絮凝,二、预处理的方法,方法：在稀溶液中加入电解质以促进凝聚和絮凝。试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。常用的絮凝剂：聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠等。,第二节 发酵液的预处理和过滤,4.色素及其他物质的去除,脱色方法：离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等。,二、预处理的方法,色素：微生物生长代谢过程

8、分泌的；培养基带来的。,第二节 发酵液的预处理和过滤,三、发酵液的过滤,过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。,目的 收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相；或是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。,第二节 发酵液的预处理和过滤,三、发酵液的过滤,2.影响固液分离的因素 细胞或菌体的大小或形状；培养基组成；发酵液黏度；发酵周期等。,第二节 发酵液的预处理和过滤,三、发酵液的过滤,3、提高过滤设备处理能力的途径,扩大设备尺寸，增加过滤面积。增大设备规模。提高过滤速度（强化设备处理能力）,提高过滤设备处理能力途径,提高

9、过滤速度,物化方法,工艺措施,结构措施,悬浮液制备过程中,悬浮液制备后,造成大颗粒固形物,固形物颗粒凝固减少固定膜厚度添加助滤剂,保持适当的滤饼厚度采取最大的允许过滤压力控制适当的悬浮液浓度固形物颗粒分级过滤,反向过滤动态过滤挤动过滤电场与磁性过滤自动化,扩大设备尺寸，增加过滤面积,第二节 发酵液的预处理和过滤,三、发酵液的过滤,第二节 发酵液的预处理和过滤,四、细胞的破碎,微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。还有许多是存在于细胞内，例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等，称为胞内产物。对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄

10、清的滤液，作为进一步纯化的出发原液。对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。,第二节 发酵液的预处理和过滤,四、细胞的破碎,各种微生物细胞壁的结构与组成,第二节 发酵液的预处理和过滤,四、细胞的破碎,A、机械法,处理量大，细胞破碎速度快。为避免机械消耗能而产生的过多热量，应采取冷冻措施，以防止生物物质的破坏。,1、细胞破碎的方法,第二节 发酵液的预处理和过滤,四、细胞的破碎,A、机械法,高压匀浆法,采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂,各种菌体一次通过高压匀浆器

11、的破碎率,1、细胞破碎的方法,第二节 发酵液的预处理和过滤,四、细胞的破碎,A、机械法,X-press法,一种改进的高压方法，是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25C至-30C形成冰晶体，利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，该法对冷冻融解敏感的生化物质不适用。,1、细胞破碎的方法,第二节 发酵液的预处理和过滤,四、细胞的破碎,A、机械法,超声波法,细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介

12、质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果极差。该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。,1、细胞破碎的方法,第二节 发酵液的预处理和过滤,四、细胞的破碎,A、机械法,研磨法,研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。,1、细胞破碎的方法,第二节 发酵液的

13、预处理和过滤,四、细胞的破碎,B、非机械法,酶解法,利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。,1、细胞破碎的方法,第二节 发酵液的预处理和过滤,四、细胞的破碎,B、非机械法,酶解法,自溶作用：所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋

14、白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。,1、细胞破碎的方法,第二节 发酵液的预处理和过滤,四、细胞的破碎,B、非机械法,渗透压冲击法,较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。,1、细胞破碎的方法,第二节 发酵液的预处理和过滤,四、细胞的破碎,B、非机械法,冰冻融化法,将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一

15、方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。,1、细胞破碎的方法,第二节 发酵液的预处理和过滤,四、细胞的破碎,B、非机械法,化学法,用酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。,1、细胞破碎的方法,第二节 发酵液的预处理和

16、过滤,四、细胞的破碎,2、破碎方法的选择,细胞的数量；所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性；要达到的破碎程度及破碎所必要的速度，尽可能采用最温和的方法；具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。,选择细胞的破碎方法时，需考虑以下因素：,第三节 分离纯化方法,一、沉淀法,最古老的分离和纯化生物物质的方法。由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法。沉淀法由于成本低、收率高(不会使蛋白质等大分子失活)、浓缩倍数高和操作简单等优点，是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：盐析法；等电点沉淀法；有机溶剂

17、沉淀法；非离子型聚合物沉淀法；聚电解质沉淀法；高价金属离子沉淀法。,第三节 分离纯化方法,二、萃取法,用一种溶剂将产物自另一种溶剂(如水)中提取出来，达到浓缩和提纯的目的。,新型的萃取技术，有：双（两）水相萃取；反相胶束（胶团）萃取；超临界萃取；液膜萃取等。,第三节 分离纯化方法,二、萃取法,1、原理,利用物质在两种成相的溶剂中溶解度的不同，使所需的目的物质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中，从而达到分离纯化的目的。溶剂萃取法是以分配定律为基础的。在萃取中欲提取的物质称为溶质，含有溶质而未被提取过的溶液称为料液，用于进行萃取的溶剂称为萃取剂，经萃取后含有溶质的萃取剂称为萃取液，而被萃取过失去溶质的

18、料液称为萃余液。,第三节 分离纯化方法,分配定律：在恒温恒压的条件下，一种物质在两种成相的溶剂中的分配浓度之比是一常数，该常数称为分配系数K。,二、萃取法,1、原理,第三节 分离纯化方法,二、萃取法,2、双水相萃取,定义,双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统。通过溶质在相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。,第三节 分离纯化方法,二、萃取法,2、双水相萃取,定义,典型的双水相系统,A类为两种非离子型聚合物；B类其中一种为带电荷的聚电解质；C类两种都为聚电解质；D类为一种聚合物与一种无机盐组成。,第三节 分离纯化方

19、法,二、萃取法,2、双水相萃取,特点,易于放大；双水相系统之间的传质过程和平衡过程快速,因此能耗较小,可以实现快速分离；易于进行连续化操作；相分离过程温和,生化分子如酶不易受到破坏；选择性高、收率高；操作条件温和。,第三节 分离纯化方法,二、萃取法,2、双水相萃取,相图,均相区,两相区,双节线：TCB系 线：TMB,第三节 分离纯化方法,二、萃取法,2、双水相萃取,相图,对于由两种聚合物和水组成的系统，其相图如左前图所示。图中以聚合物PEG的浓度(重量)为纵坐标，以聚合物Dextran的浓度(重量%)为横坐标。只有当两者达到一定浓度时才会形成两相。图中曲线把均匀区域和两相区域分隔开来，称为双节

20、线。在双节线下面的区域是均匀的，在上面的区域为两相区。例如点M代表整个系统的组成，该系统实际上由两相组成，上相和下相分别由点T和B表示。M、T、B三点在一直线上，T和B代表成平衡的两相，其相连的直线称为系线。在同一条系线上的各点分成的两相，具有相同的组成。,第三节 分离纯化方法,二、萃取法,2、双水相萃取,影响因素,环境因素：成相高聚物的种类与浓度、高聚物的亲和基团、盐的种类和浓度、成相采用的重力以及温度等；结构因素：亲水性的大小和电荷的影响。,第三节 分离纯化方法,三、吸附法,1、原理,吸附法是利用吸附剂与杂质、色素物质、有毒物质、产品之间分子引力的差异，从而起到分离的作用。,在发酵工业的下

21、游加工过程中，吸附法应用于发酵产品的除杂、脱色、有毒物质和抗生素的提纯精制。,将产品吸附浓缩于吸附剂上；将杂质、色素等需要从发酵液中去除的物质吸附于吸附剂上。,第三节 分离纯化方法,三、吸附法,2、特点,优点：可不用或少用有机溶剂；操作简便、安全、设备简单；生产过程中pH变化小，适用于稳定性较差的生化物质。缺点：吸附法选择性差、收率不高。无机吸附剂性能不稳定，不能连续操作，劳动强度大。炭粉等吸附剂影响环境卫生。,由于凝胶类吸附剂、大网格聚合物吸附剂的应用，克服了以上缺点，近年吸附法又得到重视。,第三节 分离纯化方法,三、吸附法,3、分类,物理吸附 吸附剂和吸附物通过分子力(范德华力)产生的吸附

22、。化学吸附 化学吸附是由于吸附剂在吸附物之间的电子转移，发生化学反应而产生的。交换吸附 吸附剂表面如为极性分子或离子所组成则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层。这种吸附又称为极性吸附。,三、吸附法,4、影响吸附的因素,第三节 分离纯化方法,吸附剂性质吸附物性质溶液pH值温度其他组分的影响,四、离子交换法,第三节 分离纯化方法,1、定义,指一个溶液中的某一种离子与一个固体中的另一种具有相同电荷的离子互相调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下来。这里溶液称流动相，而固体称固定相。在发酵工业中可用于分离纯化蛋白质、氨基酸、核酸、酶、抗生素等物质。,离子交换剂通常是一种不溶

23、性高分子化合物，它的分子中含有可解离的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。,四、离子交换法,第三节 分离纯化方法,1、定义,离子交换过程有两个阶段吸附和解吸附。吸附在离子交换剂上的物质可以通过改变pH使吸附的物质失去电荷而达到解离但更多的是通过增加离子强度，使加入的离子与被吸附物质竞争离子交换剂上的电荷位置，使被吸附物质与离子交换剂解开。,四、离子交换法,第三节 分离纯化方法,2、离子交换剂的分类,阳离子交换剂：磺酸(-SO3H)、磷酸(-PO3H2)、羧酸（-COOH）和酚羟基（-OH）。可分为：强酸型、中酸型和弱酸型。阴离子交换剂：伯胺、(-NH2)、仲胺(-NHCH3)、叔胺N-(CH3)2和季胺-N(CH3)2。可分为：强碱性、中碱性和弱碱性。两性离子交换剂选择性离子交换剂吸附树脂电子交换树脂,四、离子交换法,第三节 分离纯化方法,3、影响离子交换速度的因素,树脂颗粒的大小；树脂的交联度；溶液中离子浓度；温度；离子的大小；离子价；树脂强弱。,