【教学课件】第十四章特异性抗体制备技术.ppt

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1、第十四章 特异性抗体的制备技术Preparation of Specific Antibody,第一节 免疫原的制备 第二节 免疫血清的制备 第三节 单克隆抗体的制备 第四节 基因工程抗体技术,目的要求1、掌握：颗粒性的制备；免疫血清的制备；杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理；2、熟悉：常用可溶性抗原制备的方法、多克隆抗体制备的影响因素，常用佐剂种类；3、了解：抗血清的鉴定；基因工程抗体技术。,一、颗粒(细胞)性抗原制备 二、可溶性免疫原制备 三、人工抗原的制备 四、佐剂,绵羊红细胞的制备流程图,摇动 15-20min,4,可保存2周,取适量,NS洗涤3次 2000r/min 10min,NS

2、稀释至 25%,细菌细胞抗原的制备流程图,液体培养或 斜面培养 3724h,100水浴 22.5h 杀菌,无菌试验,NS稀释成810亿/ml,O菌体抗原,返回,可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸 来源:主要是组织和细胞，其成分也比较复杂。(一).组织和细胞可溶性抗原的制备(二).蛋白质的提纯(三).免疫球蛋白片段的制备(四).纯化抗原的鉴定,二、可溶性抗原制备及鉴定,1.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4.表面活性剂处理,细胞破碎技术及评价,常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 方法：在一定的条件下，能消化细菌和 组织细胞 特点：此法适用多种微生物；

3、具有作用条件温和；内含物成分不易受到破坏；细胞壁损坏的程度可以控制。,1.酶处理法,2.超声破碎法,原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生的空化作用使得液 体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成 与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。特点：操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。,3.冻融法,原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然 后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织 细胞及细胞内的颗粒可被融破；特点：此法适用于组织细胞，对微生物细 胞作用较差。,4.表面活性剂处理,原理：在适当

4、的温度、pH及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。应用：破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。,4.表面活性剂处理,蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高的 抗血清通常需要纯化。可采用如下方法：1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5.亲合层析法,蛋白质抗原制备,原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不 同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同 密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。特点：用超速离心或梯度

5、密度离心法纯化抗 原，极难将某一抗原成分分离出来。应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻 的抗原物质的分离，如IgM、ApoA、ApoB等。,1超速离心法,原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用 各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的。常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用3350饱和度的硫酸胺。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。,2、选择性沉淀法,原理：凝胶是具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当的溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分 子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结

6、构内，在凝胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分成大、中、小三种类型。特点：简单易行，但掌握不好，分离效果较差。,3凝胶层析法（凝胶过滤法）,原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使血清中的蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。,4离子交换层析法,原理：依据Ag、Ab的生物学活性进行分离和

7、提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于固相载体上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与吸附剂上抗IgG结合；当改变洗脱条件可重新解离，从而将待分离的IgG洗脱下来，达到纯化的目的。优点：提取纯度高、Ag、Ab不失活性。,5亲和层析法（亲和色谱）,大分子的核酸具有免疫原性。提取核酸的主要步骤：,核酸抗原制备,1酶裂解法 酶对免疫球蛋白的水解有极好 的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解 为不同的片段。2氧化法和还原法 是将免疫球蛋白轻、重 链分开的两种常用方法。3.还可用强变性剂或利用改变pH将免疫球蛋 白亚单位分开。,免疫球蛋白片段制备,酶水解免疫球蛋白示意图,Fc段，用

8、以制备抗重链血清,F(ab)2，常作为抗体试剂用于试验,木瓜蛋白酶（papain),胰蛋白酶(pepsin),胃蛋白酶(pepsin),1.氧化法：优点是切开后，肽链不能重新形 成二硫键、便于肽链纯化；缺点是色氨酸 侧链容易被破坏。2.还原法：将二硫键还原成琉基。但极不稳 定，易重新形成二硫键，必须及时用碘乙 酸或碘化酰胺进行羧甲基化。,氧化法和还原法评价,纯化抗原的鉴定,(四)纯化抗原的鉴定 1.含量鉴定 2.分子量鉴定凝胶层析技术进行测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶管状电泳 超速离心 3.纯度鉴定：免疫电泳，醋酸纤维膜电泳 4.免疫活性鉴定：常用双向琼脂扩散试验,三、人工抗原的制备,人工抗原

9、：是指经过人工修饰后具有免疫原性的半抗原。如：低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。,(一)载体的选择 1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)，这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动物产生高效价、高亲和力的抗体。3.大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 可诱发动物产生抗体。(二)半抗原与载体的连接,碳化二亚胺法：,R-NH=CH-R,半抗原载体蛋白质,搅拌12h,室温

10、24h,透吸除去未反应的半抗原,人工免疫原,半抗原载体连接方法1,混合,碳化二亚胺法：,R-NH=CH-R,半抗原载体蛋白质,搅拌12h,室温24h,透吸除去未反应的半抗原,人工免疫原,半抗原载体连接方法1,混合,氯甲酸异丁脂法：,半抗原载体连接方法3,简便，用于类固醇抗原制备,半抗原-CH2OH,CH2-CO CH2-CO,带羧基的半抗原琥珀酸衍生物,半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH,吡啶,再经氯甲酸异丁脂法或碳化 二亚胺法制备载体半抗原,半抗原载体连接方法4,四、佐剂,*概念：与抗原同时或预先注射于机体，能增加机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。,四、佐剂,1.氢氧化铝佐

11、剂：,5%硫酸铝,5%氢氧化钠,氢氧化铝沉淀,制成悬液 即为佐剂,强烈搅拌,NS洗 二次,NS,等体积抗原,免疫接种,（二）常用佐剂的种类和制备,目的:增强抗原对机体的免疫原性；增强抗体的产生能力；为制备出高效价的免疫血清；增强可溶性抗原的免疫原性；在某种情况下，要改变抗原免疫应答类型；延长抗原在免疫动物的时间；改变抗原的分布；增强局部对变应原的超敏反情况；,4.佐剂应用原则和评价,佐剂常混有微量其它物质，这些物质进 入体内后也可引起抗体的产生，影响抗 血清的特异性；注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌 性脓肿；反复注射，易发生超敏反应，使局部组 织坏死，甚至引起动物死亡。,应用佐剂的缺点,第二

12、节 免疫血清的制备,一.选择免疫动物 二.免疫方法 三.动物采血法 四.免疫血清的纯化 五.抗血清的鉴定与保存,能作为免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。(一).抗原与动物种属关系：差异越远越好；(二).动物的个体状况：适龄、健壮、正常、体重合乎要求；(三).抗原的性质：不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答；(四).按免疫血清用量和要求,一、免疫动物选择,(一).免疫原的注射剂量(二).免疫间隔时间：首次与二次尤为重要(间隔1020天），整免疫过程5至8次。(三).免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌,二、免疫方法,1.颈动脉放血法：

13、羊、兔最常用的方法 2.静脉采血法：羊、兔，小鼠断尾或眼球 3.心脏采血法：操作熟练如兔、豚鼠、鸡,三、动物采血法,四、免疫血清的纯化(一)特异性抗体的纯化 1.亲合层析法：将交叉抗原交联到epharose 4B上，装柱，将预吸收抗体通过亲合层析柱，杂抗体吸在柱上，流出液是特异性抗体。2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。,(二)IgG类抗体的纯化 1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取球蛋白3次，基本为IgG类抗体，但不纯。2.离子交换层析法：DEAE纤维素或QAE纤维素。3.亲和层析法：将抗原交联Sepharose 4B

14、制成亲和层析柱(抗血清、过柱、洗脱、改变洗脱液酸硷度、IgG从层析柱解离、收集)。,五、抗血清的鉴定与保存,(一).抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定(二).抗体特异性鉴定：细菌类抗原的抗体用凝集试验 可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验(三).抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法(四).抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好,(五)抗血清的保存 1.4保存：可保存36个月 2.低温保存：-20-40可保存23年 3.冰冻干燥保存：可保存35年,第三节 单克隆抗体的制(Preparation of Monoconal Antibody,McAb),概述,1975年Kohler和Milstein首先运用细胞杂

15、交技术将经绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，建立第一个B细胞杂交瘤细胞株，并成功制得抗SRBC的单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb)。迄今数以千计的单克隆抗相继问世。,定义：McAb是由B淋巴细胞杂交瘤产生的只识别抗原分子上某一抗原决定簇的纯抗体。,McAb的特点：,1、特异性强2、高度的均一性和可重复性3、效价高4、可无限供应5、具有单一的生物学功能6、对环境敏感,一、杂交瘤技术的基本原理 将具分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。,(一)亲本细胞的选择与融合 1.致敏B细胞 抗原诱导B细胞(脾细胞)2.骨髓瘤细胞

16、能在体外长期增殖并易与B细胞融合 3.细胞融合 融合剂：PEG(聚乙二醇),(二)选择培养基的应用 HAT培养基选择培养杂交瘤细胞 次黄嘌呤(H)，氨基蝶呤(A)，胸腺嘧啶(T)二、单克隆抗体制备技术 单克隆抗体制备流程图14-1,单克隆抗体制备流程图,(一)抗原免疫 体外免疫法：特点具简便、时间短、抗原浓度恒定、免疫原性强。(二)细胞融合 将致敏B细胞与骨髓瘤细胞混合培养(三)抗体初筛与克隆化 选择抗体阳性培养孔、从中分离出单一细胞株培养(克隆),(四)杂交瘤细胞的冻存与复苏 抗体阳性细胞株及早冻存，避免细胞污染、染色体丢决、细胞死亡(五)单克隆抗体的批量生产 体内诱生法为主(六)单克隆抗体

17、的止与鉴定 纯化：生化技术纯化 鉴定：含量、纯度、特异性及亲和性,三、单克隆体抗在医学中的应用,1、诊断各类病原体如乙肝病毒、EB病毒等。2、肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测 如AFP、CEA等3、检测淋巴细胞的表面标志 如CD3、4、8等4、“生物导弹”以McAb作为载体携带某些药物或毒素，将其携带至靶器官，从而有效地发挥药物作用，直接杀伤靶细胞。,第四节 基因工程抗体技术(自学)基因工程抗体：应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体基因按不同需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。一、人源化抗体(一)嵌合抗体 1.抗体V区基因的克隆 2.抗体C区的选择 3.表达载体的构建 4.表达,(二)改形抗体(RAb)1.RAb的分子设计 2.RAb的基因构建,二、小分子抗体(一)Fab(二)FV和ScFv,三、双特异性抗体(一)化学交联BsAb(二)细胞工程BsAb(三)基因工程BsAb,四、抗体融合蛋白(一)含Fv的抗体融合蛋白(二)含Fc的抗体融合蛋白,五、抗体库技术(一)抗体库技术的流程(二)抗体亲和力成熟,课外作业1、简述单克隆抗体制备技术的主要步骤。2、叙述杂交瘤技术的基本原理。,谢谢！,Thank you for your attention!,