【教学课件】第二章蛋白质.ppt

《【教学课件】第二章蛋白质.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【教学课件】第二章蛋白质.ppt（138页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第二章 蛋白质,授课目的：本章主要阐述蛋白质的主要功能、性质以及蛋白质的分离纯化，并在此基础上简要地阐明蛋白质结构与其性质及功能的关系。授课时数：8学时,第一节 蛋白质概述,第二节 氨基酸蛋白质的构件分子,第三节 肽,第四节 蛋白质的结构与功能的关系,第五节 蛋白质的理化性质,第六节 蛋白质的分离、纯化,授课时序：,第一节 蛋白质概述,一、蛋白质的生物学功能二、蛋白质的分类三、蛋白质的水解四、蛋白质的组成成分,一、蛋白质的生物学功能,1.生物体的组成成分2.酶3.运输4.运动5.抗体6.干扰素7.遗传信息的控制8.细胞膜的通透性9.高等动物的记忆、识别机构,构成生物机体的结构蛋白如肌动蛋白、肌

2、球蛋白,具有催化功能的蛋白质,免疫球蛋白,二、蛋白质的分类,依据蛋白质的外形分类：按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。球状蛋白质：globular protein外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质：fibrous protein分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。,（2）依据蛋白质的组成分类,按照蛋白质的组成，可以分为：简单蛋白(simple protein)结合蛋白(conjugated protein)。,简单蛋白,又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨酸组成的肽链，不含其它成分。1.清蛋白和球蛋

3、白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。2.谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。3.精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。4.硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,结合蛋白质,由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清

4、-，-脂蛋白等。核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。,完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元。大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。这20种氨基酸被称为基本氨基酸。,三、蛋白质的水解,1.酸水解常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约20小时。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。,胃蛋白酶Pepsin：R1和R2R1

5、=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。,一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。,2.碱水解,目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。,3.酶水解,蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解.多肽是由

6、氨基酸以酰胺键形式连接而成的线性大分子。它在生物体内可以单独存在，但是更多的则是作为蛋白质的组成部分。蛋白质是由一个或多个多肽链通过共价键（主要是二硫键）或非共价力结合而成。应用化学或物理方法，可以将蛋白质拆分成多肽组分。,胰蛋白酶Trypsin：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。,或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。,糜蛋白酶,四、蛋白质的组成成分,蛋白质是由许多不同的-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大

7、分子。,蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：,三 蛋白质的元素组成,碳 50 氢 7 氧 23 氮 16%硫 03 其他 微 量,N的含量平均为16%凯氏（Kjadehl）定氮法的理论基础。,氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数 6.25,（二）蛋白质的氨基酸组成,氨基酸 是蛋

8、白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种标准氨基酸（20 standard amino acids)组成。形成复杂的氨基酸长链，中间靠肽键连接，形成多肽或蛋白质。,第二节 氨基酸蛋白质的构件分子,一、蛋白质的基本组成单位氨基酸 氨基酸是具有氨基（-NH3+）或亚氨基和羧基（-COOH）的有机分子。氨基酸种类多，但构成蛋白质具有遗传密码的氨基酸只有20种，且都是L-型的-型氨基酸，其通式为：,C如是不对称C（除Gly），则：具有两种立体异构体 D-型和L-型2.具有旋光性 左旋（-）或右旋（+）,氨基酸的构型是以距羧基最近的手性C原子为标准（除Gly外），而糖的构型是以距羧基最远的

9、手性C原子为标准。,氨基酸分子中既含有NH2，有含有COOH，所以氨基酸与强酸强碱都能成盐，实际上氨基酸本身就能形成内盐。,二 氨基酸的分类,根据R的化学结构（1）脂肪族氨基酸：1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；2）极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）杂环氨基酸：Trp、His（4）杂环亚氨基酸：Pro,2.根据R的极性（1）极性氨基酸：1）不带电：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；2）带正电：His、Lys、Arg；3）带负电：Asp、Glu（2）非极性氨基酸：Gly、Al

10、a、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp,三 氨基酸的重要理化性质,（一）一般物理性质 溶解度：水中溶解度差别较大，不溶于有机溶剂。光吸收性：可见光区无光吸收，紫外光区Phe、Thy、Trp有光吸收。旋光性：AA的物理常数，与结构、PH值有关。味感：不同味道(与构型有关).,（二）两性解离和等电点 氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的NH3+正离子和能接受质子的COO-负离子，为两性电解质。,调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的NH3+基和COO-基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸

11、的等电点（pI）。,等电点的含义,1.定义：当氨基酸在其某一PH值时，氨基酸所带正电荷和负电荷相等，即净电荷为零，此时的PH值成为氨基酸的等电点，用PI表示。氨基酸在等电点时主要以偶极离子形式存在。2.氨基酸等电点的特点：净电荷数等于零，在电场中不移动；此时氨基酸的溶解度最小。,氨基酸等电点的确定：,1、酸碱滴定,2、根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。,Gly的滴定曲线,Gly解离作用,（三）化学性质,（1）与茚三酮的反应：Pro产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（几g）。,（2）与甲醛的反应：氨基酸

12、的甲醛滴定法,OH-,中和滴定,（3）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应,弱碱性,DNP-氨基酸,取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高,（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,pH8.3,无水HF,重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”,（5）成盐反应,（6）酰基化和烃基化反应,（7）成酯反应,HCl气,当羧基变成乙酯后，羧基的化学性质就被掩蔽了，而氨基的化学性质就突出地显示出来。,（8）酰氯化反应,使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基结合，在合成肽的工作上常用。,（9）成酰胺反应,H2NCHRCOOC2H5+HNH2,体外,无水,有机体内：,Asp（Gl

13、u）+NH4+,Asn（Gln）,Asn（Gln）合成酶,ATP,（10）脱羧反应,H2NCHRCOOH,脱羧酶,（11）迭氮反应,H2N-CHR-COOH,NH2NH2,（-CH3OH）,HNO2,第三节 肽,一、肽 一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物。氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）。,.,肽键肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。,当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在一端仍然有游离的氨基和另一端有游离的羧基，每一端连接更多的

14、氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽（25个氨基酸残基以下）和多肽（多于25个氨基酸残基）。多肽仍然有游离的-氨基和-羧基。少于10AA成为寡肽，多于10AA成为多肽或聚肽。分子量大于10000d称为蛋白质，小于10000d称为多肽。,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,（一）谷光甘肽（GSH）,2GSH,GSSG,（二）催产素和升压素,均为9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，

15、具有催产和促使乳腺排乳作用。升压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。,（三）促肾上腺皮质激素（ACTH）,39肽，活性部位为第410位的7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。,（四）脑肽,脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。,Met-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu,-内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用。,（五）胰高血糖素,由胰岛-细胞分泌（-细胞分泌胰岛素），29肽。胰高血糖素调节 维持血糖浓度。,第四节 蛋白质的结构与功能的关系,蛋白质是由一条或多条多肽(polype

16、ptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。,蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）（conformation）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。蛋白质有四种结构层次：一级结构primary），二级结构（secondary），三级结构（tertiary）和四级结构（quaternary）（不总是有）。,一、稳定蛋白质的作用力,共价键,次级键,化学键,肽键,一级结构,氢键,二硫

17、键,二、三、四级结构,疏水键,盐键,范德华力,三、四级结构,蛋白质分子中的共价键与次级键,二硫键,一、共价键,蛋白质分子中的共价键有肽键和二硫键。是生物大分子分子之间最强的作用力，化学物质（药物、毒物等）可以与生物大分子（受体蛋白或核酸）构成共价键，共价键除非被体内的特异性酶催化断裂以外，很难恢复原形，是不可逆过程，对酶来讲就是不可逆抑制作用。,二、非共价键,生物体系中分子识别的过程不仅涉及到化学键的形成，而且具有选择性的识别。共价键存在于一个分子或多个分子的原子之间，决定分子的基本结构，是分子识别的一种方式。而非共价键（又称为次级键或分子间力）决定生物大分子和分子复合物的高级结构，在分子识别

18、中起着关键的作用。,1.静电作用,静电作用是指荷电基团、偶极以及诱导偶极之间的各种静电吸引力。酶、核酸、生物膜、蛋白质等生物大分子的表面都具有可电离的基团和偶极基团存在，很容易与含有极性基团的底物或抑制剂等生成离子键和其它静电作用。,（1)离子键,生物大分子表面的带电基团可以与药物或底物分子的带电基团形成离子键。这种键可以解离。,(2)离子偶极作用,药物分子和受体分子中O、S、N和C原子的电负性均不相等，这些原子形成的键由于电负性差值可以产生偶极现象。这种偶极部分与永久电荷可以形成静电作用.离子-偶极相互作用一般比离子键小得多，键能与距离的平方差成反比，由于偶极矩是个向量，电荷与偶极的取向会影

19、响药物-受体的作用强度。如普鲁卡因及其衍生物的局部麻醉作用与酯羰基的偶极性质有关。,(3)偶极-偶极相互作用,两个原子的电负性不同，产生价键电子的极化作用，成为持久的偶极两个偶极间的作用。偶极偶极相互作用的大小，取决于偶极的大小、它们之间的距离和相互位置。这种相互作用在水溶液中普遍存在。它的作用强度比离子偶极作用小，但比偶极诱导偶极作用大。这种作用对药物受体相互作用的特异性和立体选择性非常重要,2.氢键,氢键的形成 氢键是由两个负电性原子对氢原子的静电引力所形成，是一种特殊形式的偶极偶极键。它是质子给予体X-H和质子接受体Y之间的一种特殊类型的相互作用。氢键的大小和方向 氢键的键能比共价键弱，

20、比范德华力强，在生物体系中为8.433.4kj/mol(2-8kcal/mol)。键长为0.250.31nm，比共价键短。氢键的方向用键角表示，是指XH与HY之间的夹角，一般为180250。,3 范德华力,这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它是一种比较弱的、非特异性的作用力。这种作用力非常依赖原子间的距离，当相互靠近到大约0.40.6nm(46A)时，这种力就表现出较大的集合性质。范德华力包括引力和排斥力，其中作用势能与1/R6成正比的三种作用力（静电力、诱导力和色散力）通称为范德华引力。,4疏水作用,疏水作用是指极性基团间的静电力和氢键使极性基

21、团倾向于聚集在一起，因而排斥疏水基团，使疏水基团相互聚集所产生的能量效应和熵效应。蛋白质和酶的表面通常具有极性链或区域，这是由构成它们的氨基酸侧链上的烷基链或苯环在空间上相互接近时形成的。高分子的蛋白质可形成分子内疏水链、疏水腔或疏水缝隙，可以稳定生物大分子的高级结构。,一 蛋白质的一级结构,就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。一级结构中包含的共价键（covalent bonds）主要指肽键（peptide bond）和二硫键（disulfide bond）,一级结构确定的原则：将大化小，逐段分析，制成两套肽

22、片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。,目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构。,一级结构测定的顺序：,（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目（2）拆分蛋白质分子的多肽链。（3）断开多肽链内的二硫桥。（4）分析每一多肽链的氨基酸组成。（5）鉴定多肽链的N一末端和C一末端残基。（6）裂解多肽链成较小的片段用两种或几种不同 的断裂方法。（7）测定各肽段的氨基酸序列。（8）重建完整多肽链的一级结构。（9）确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥的位置。,二、蛋白质的高级结构 蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。,由于羰基碳-氧双键的靠拢，允许存在

23、共振结构（resonance structure），碳与氮之间的肽键有部分双键性质，由CO-NH构成的肽单元呈现相对的刚性和平面化，肽键中的4个原子和它相邻的两个-碳原子多处于同一个平面上。,氨基的H与羰基的O几乎总是呈反式（trans）而不是顺式（cis）。,蛋白质构象稳定的原因：1）酰胺平面；2）R的影响。,1.蛋白质的二级结构,指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式,（1）-螺旋（-helix）,结构要点：1）螺旋的每圈有3.6个氨基酸，螺旋间距离为0.54nm，每个残基沿轴旋转100。,2）每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基酸氨基上的氢形成氢键（hydrogen bond），氢键的走向平行于

24、螺旋轴，所有肽键都能参与链内氢键的形成。,3.613(ns),多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键(13个原子)。蛋白质分子为右手-螺旋。,（1）-螺旋,（2）-折叠结构（-pleated sheet）,是一种肽链相当伸展的结构。肽链按层排列，依靠相邻肽链上的羰基和氨基形成的氢键维持结构的稳定性。肽键的平面性使多肽折叠成片，氨基酸侧链伸展在折叠片的上面和下面。

25、,-折叠片中，相邻多肽链平行或反平行（较稳定）。,-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。,（2）-折叠,在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,（3）-转角-turn,-转角（-turn）,为了紧紧折叠成紧密的球蛋白，多肽链常常反转方向，成发夹形状。一个氨基酸

26、的羰基氧以氢键结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。,-转角经常出现在连接反平行-折叠片的端头。,R侧链基团伸向螺旋的外侧。,Pro的N上缺少H，不能形成氢键，经常出现在-螺旋的端头，它改变多肽链的方向并终止螺旋。,2.超二级结构和结构域,超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。,结构域是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球行的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。,蛋白质a结构,蛋白

27、质两个结构域示意图,3.蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水相互作用，在蛋白质三级结构中起着重要作用。,血红蛋白,血红蛋白是脊椎动物红细胞主要组成部分，它的主要功能是运输氧和二氧化碳。血红蛋白中，血红素Fe原子的第六配价键可以与不同的分子结合：无氧存在时，与水结合，生成去氧血红蛋白(Hb)；有氧存在时，能够与氧结合形成氧合血红蛋白(HbO2)。血红蛋白与氧的结合不牢固，

28、容易离解。HbO2 的形成和离解受氧的分压和pH等因素的影响，氧的分压和pH较高时，有利于血红蛋白与氧的结合，反之，则有利于离解。,血红蛋白的功能,血红蛋白除了运输氧和CO2外，还能够对血液的pH起缓冲作用。因为HbO2在释放出一分子氧的同时，结合一个氢质子。这样就可以消除由于呼吸作用产生的CO2引起pH的降低。,3、蛋白质的四级结构,蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位Subunit，它一

29、般由一条肽链构成，无生理活性；维持亚基之间的化学键主要是疏水力。由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白；,四级结构的结构模型,两个亚基的结构,三、蛋白质分子结构与功能的关系,蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。,（一）蛋白质一级结构与功能的关系,1.种属差异,蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近。,2.分子病,蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病。,镰状细胞贫血（sick-cell anemia）从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞

30、。,-链 1 2 3 4 5 6 7Hb-A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-LysHb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys,Val 取代Glu,O2,O2,（二）蛋白质构象与功能的关系,别（变）构作用：含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变的作用。因别构而产生的效应称别构效应。,肌红蛋白是1957年由John Kendrew 用X射线晶体分析法测定的有三维结构的第一个蛋白质。它是典型的球形蛋白质，高度折叠成紧密结构，疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子内部，极性残基在表面。肌红蛋白中有8条-螺旋。由多肽的折叠形成

31、的疏水空隙内是血红素辅基，通过肽链上的His残基与肌红蛋白分子内部相连，它对肌红蛋白的生物活性是必需的（与O2结合）。,第五节 蛋白质的性质,一、蛋白质的相对分子量,蛋白质相对分子量在10 0001 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在2550*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）,v=沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中

32、心的距离（cm）,二、蛋白质的两性解离及等电点,蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。,电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。1.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。3.纸上电泳：用滤纸作支持物。,（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。,等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动

33、。,通电,三、蛋白质的胶体性质,蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）；2）带相同电荷。布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力,四、蛋白质的沉淀反应,1.加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。,分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,不可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破

34、坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀,1.加有机溶剂2 加重金属盐 加生物碱试剂单宁酸、苦味酸酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂,可逆沉淀,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,五、蛋白质的变性,蛋白质的性质与它们

35、的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation）发生变性的蛋白质一级结构（构型）和分子量不变，高级结构（构象）遭到破坏。,有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质（复性作用）。,变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被酶消化。,变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引

36、起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,变性作用,蛋白质复性,六蛋白质的颜色反应,OH,N,第六节 蛋白质的分离纯化测定,为了测定蛋白质的氨基酸组成，从蛋白质水解液中制取AA，都需要对AA混合物进行大小不同的分离、纯化方法。,（一）根据分子大小不同进行分离纯化,1、透析和超过滤 透析和超过滤都是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质分开。超过滤是利用压力或离心力，强使水和其它小分子溶液透过半透膜，而蛋白质留在膜上。,透析与超过滤简易装置,（二）根据溶解度差别的分离方法,1.等电点沉淀和PH值控制 利用各种蛋白质在等电点时，溶解度最小这一性质，可以通过调

37、节蛋白质溶液的PH值，将不同的蛋白质分开。2.蛋白质盐溶或盐析 中性盐在低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度，这种现象叫盐溶。当溶液离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度下降开始沉淀，这种现象叫盐析。,（三）根据电荷不同的分离方法,1.电泳 在外界电场的影响下，如果蛋白质不处于等电点状态，它将向电极移动，这种现象称为电泳。纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯度、制备蛋白质。,常见垂直平板电泳示意图,2.层析 层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个“相”中，这两个相中的一个被固定在一定的支持介质上

38、，成为固定相，另一个是移动的，成为移动相。根据层析法的原理与方式的不同，层析法有分配层析、吸附层析、离子交换层析、亲和层析等不同类别。,凝胶过滤层析,凝胶过滤又称分子筛层析（molecular-sieve chromatography)。这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。凝胶过滤是一种柱层析，柱中的填充物是大分子的惰性聚合物，最常用的有葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex)和琼脂糖凝胶（商品名为.Sepharose）等。葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“网孔”大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到。不同型号的葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子的蛋白质混合物借助重力

39、通过层析柱时，比“网孔”大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒的网格内，而被排阻在凝胶粒之外，随着洗脱剂通过凝胶粒外围而流出；比“网孔”小的分子则扩散进入凝胶粒内部，然后再可逆地扩散出来通过下层凝胶。这样，由于不同大小的分子所经路程不同而得以分离，大分子先洗下来，小分子后洗下来。,凝胶层析原理及流程,离子交换层析,离子交换层析分离蛋白质也是根据其带电荷的情况。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（carboxymethyl-cellulose,简称CM一纤维素）和弱碱性的二已基氨基已基纤维素（diethyl-amino-ethyl-cellulose，简称DEAE一纤维素），前者为阳离子

40、交换剂，后者为阴离子交换剂。离子交换层析原理及简单流程：离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷的静电吸引，这与溶液的pH值有关，因为溶液的PH值决定离子交换剂与蛋白质的电离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的离子和蛋白质的相反电荷基团之间的静电吸引。因此，蛋白质混合物的分离可用改变溶液中盐类离子强度和PH值来完成。对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先由层析柱中洗脱出来。,离子交换原理及流程示意图,亲合层析,亲和层析(affinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法。它经常只需经过一步的处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种

41、方法根据的是某些蛋白质所具有的生物学性质，即它们与另一种称为配体的分子能特异而非共价的结合。,亲合层析原理及流程示意图,五 蛋白质含量的测定,（一）蛋白质含量的测定：1.紫外光吸收法：此法是用紫外吸收分光光度计在紫外光区测定蛋白质的光吸收，从而测定蛋白质含量的方法。,2.双缩脲法,在强碱性溶液中，蛋白质与CuSO4反应，生成紫红色化合物，这个反应称为双缩脲反应（biuret reaction)。在碱性条件下，蛋白质与CuSO4所生成的颜色深浅与蛋白质的浓渡成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关。将样品同标准蛋白质同时试验，并于540-560nm波长下侧其光吸收值，通过标准曲线曲线即可求得蛋

42、白质的含量。此方法简便、迅速，不受蛋白质特异性的影响，但方法的灵敏度较差，所需样品量大（）。,3福林一酚试剂法,福林一酚试剂（Folin-phenol reagent)包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸及磷钨酸的混合试剂。碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应，这是蛋白质中肽键的反应，这种被作用的蛋白质中的酚基（酪氨酸），在碱性条件下很容易将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，所生成蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，因此，在650nm或660nm波长下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。这个方法实际上是劳里（Lowry,O,H.,1951）在原方法的基础上加以改进了的，常称Lowry法，具有操作简便、灵

43、敏度高（比双缩脲法灵敏100倍）等优点。蛋白质测定范围为25-250g/ml。但不同蛋白质显色强度稍有不同，而且酚类物质和柠檬酸有干扰。,4.紫外吸收法,蛋白质分子中酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，由于在各种蛋白质中这几卜种组基酸含量差别不大，所以280nm的吸收值与浓度具正相关，可用于蛋白质含量的测定。此种方法称为280nm吸收法。其方法简便，测定迅速，样品可回收，低浓度盐无干扰。但若样品蛋白质中酪氨酸含量与标准蛋白质比较差别较大，则测定有一定误差，其它具有紫外吸收的物质（如核酸类）有干扰。另外，280nm和260nm吸收差法也常用于蛋白质含量的测定。在被测样品中常含有核酸类物质

44、。利用核酸类物质的吸收值在260nm大于280nm，而蛋白质的吸收值在280nm大于260nm的特性，可分别于280nm和260nm波长下测定光吸收值（分别以A280和A260表示）。然后按下列经验公式计算蛋白质的含量：蛋白质浓度（mg/ml)=1.45A280一,蛋白质作为机体的结构成分而存在，常见的蛋白质的生物机能：,肌肉的构成,骨骼肌以及很多非肌肉细胞含有两种形成特有的纤维状或丝状结构的蛋白质：肌球蛋白和肌动蛋白。按生物功能来说它们不是基本的结构蛋白质，它们参与需能的收缩活动。肌球蛋白是一种很长的捧状分子，有两条彼此缠绕的“螺旋肽链的尾巴和一个复杂的“头”。它的总分子量为450000，约

45、160nm长，实际上含有六条肽链。长尾巴是由二条分子量各为200000的肽链组成，这两条肽链称为重链(heavy chain H链)。重链具有柔软的可转动铰链。头是球形的，含有重链的末端和四条轻链(light chain，L链)，其中两条称作L2，分子量为18000，另外两条称为Ll和L3,分子量分别为16000和25000。肌球蛋白分子的头部具有酶活性，催化ATP水解成ADP和磷酸，并释放能量。许多肌球蛋白分子装配在一起形成骨骼肌的粗丝(thick filament)。肌球蛋白也存在于非肌肉细胞内。,在骨骼肌中与粗丝紧密缔合在一起的是细丝(thin filament)，它由肌动蛋白组成。肌动

46、蛋白以两种形式存在，球状肌动蛋白(G肌动蛋白)和纤维状肌动蛋白(F肌动蛋白)。纤维状肌动蛋白实际上是一根由G肌动蛋白分子(分子量为46000)缔合而成的细丝。两根F肌动蛋白细丝彼此卷曲形成双股绳索结构。,肌肉收缩过程,免疫球蛋白,免疫球蛋白是一类血浆糖蛋白(serum glycoprotein)。糖蛋白中的蛋白质与糖是共价联接的。免疫球蛋白是被脊椎动物作为抗体合成的。它的合成场所是网状内皮系统的细胞。这些细胞分布在脾、肝和淋巴节等组织中。当一类外来的被称为抗原的物质，如多糖、核酸和蛋白质等侵入机体时即引起抗体的产生，这就是所谓免疫反应。抗体就是免疫球蛋白。,免疫球蛋白的结构,免疫球蛋白G,人的

47、免疫球蛋白可分为五大类，其分子量范围从150000到950000道尔顿。免疫球蛋白M(IgM)是对一个抗原作出反应时产生的第一个抗体。免疫球蛋白G(IgG)是一类最简单的免疫球蛋白。IgG含有两条相同的高分子量的重链(heavy chain)和两条相同的低分子量的轻链(light chain)。四条链通过二硫键共价联接成Y字形结构。每一免疫球蛋白分子含有二个抗原结合部位，它们位于Y形结构的二个顶点。,立体结构模型,抗体的特点,抗体具有两个最显著的特点，一是高度特异性，二是多样性。高度特异性就是一种抗体一般只能与引起它产生的相应抗原发生反应。抗原抗体复合物往往是不溶的，因此常从溶液中沉淀出来，此即“沉淀反应”。在体外，沉淀反应已被广泛用于研究抗原抗体反应，并成为免疫学的基础。多样性就是它们可以和成千上万的各种抗原(天然的和人工的)起反应。般说来，一个抗原与接受该抗原的动物关系愈远，则产生抗体所需的时间愈短，抗体反应也愈强。,抗原,某些低分子量的物质可以与抗体结合，但它们本身不能刺激抗体的产生。如果它们与大分子紧密结合，则能刺激抗体的产生。这些小分子物质称为半抗原(hapten)。几乎所有外来的蛋白质都是抗原，并且每种蛋白质都能诱导特异抗体的产生。一个人得体内在任一个给定时刻大约有10000种抗体存在。,下课了！,