【教学课件】第二章工业微生物基础.ppt

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1、第二章工业微生物基础,1、微生物的特点 2、常见的工业微生物 3、工业微生物菌种的分离和选育4、工业微生物菌种的改良5、工业微生物菌种的保藏6、工业微生物菌种的扩大培养,教 学 内 容,重点内容,一、微生物的特点,1、种类多，分布广2、高面积-体积比，代谢能力强3、生长迅速，繁殖快4、适应性强，容易培养5、易变性,二、常见的工业微生物,微生物指是指那些个体微小，结构简单，必须借助显微镜的帮助才能看清它们外形的一群微小生物。,广义的微生物包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。在发酵工业中经常遇到的是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害、放线菌生长的噬菌体。

2、,1、细菌,芽孢：某些细菌在其生长发育后期，可在细胞内 形成一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体。抗热、抗辐射、抗化学物质。如热解糖梭菌的营养细胞在50度下经短时间即被杀死，而它的一群芽孢在132度下经4分多钟才能杀死其中的50%。,2、放线菌,属原核单细胞生物，有球菌、杆菌和螺旋菌三类，分革兰氏阳性菌和阴性菌。在发酵专业中常用的是杆菌，它易形成芽孢。,属原核生物，菌落呈放射状，广泛存在于泥土中，最大经济价值是用来生产抗生素。,3、霉菌,4、酵母菌,属真核生物，俗称丝状真菌。在发酵工业、农业、食品和皮革等方面有重要用途，但易引起工业原料、产品和农副产品的发霉变质。,属真核单细胞生物，主要生长在偏酸含

3、糖量较高的环境中，中酒精、饮料等生产中有重要用途。,5、噬菌体,噬菌体侵染细菌过程课件欣赏,三、工业上常用的微生物及用途,列表超级链接,问题：在发酵生产中，哪些是工业上常用的微生物？,是一种感染原核生物的病毒。分烈性噬菌体和温和噬菌体。能严重危害发酵生产。,四、工业微生物菌种的分离和选育,地点方法,目的方法,方法,方法,育种,（二）选育1、选育的目的 就是要改善菌种的特性，使能提高产量、改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。2、基本方法 自然选育、生产育种、抗噬菌体菌株的选育、诱变育种、代谢控制育种及原生质体技术和体外重组DNA技术（基因工程）等。,缺点：产量低、副产物多、生产周

4、期长。,菌种选育就是按照生产的要求，根据微生物的遗传和变异的理论，用人工方法造成菌种变异，再经过筛选而达到菌种选育的目的。,野生型菌株、变异菌株、菌种选育,名词,原生质体融合基本过程示意图,诱变育种一般采用物理、化学诱变因素使微生物DNA的碱基排列发生变化，以使排列错误的DNA模板形成异常的遗传信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞的功能发生改变。（此为较传统的方法P16）代谢控制育种主要有两个方面：一方面是改变代谢通路的育种，另一方面改变代谢自动调节系统的育种。有关育种的方法在微生物学中已详细介绍，这里不再赘述。,原生质体融合基本过程示意图 P19,细胞壁,细胞壁溶解,细胞膜,营养细胞,原生质

5、体,原生质体融合,融合细胞,原生质体融合,原生质体形成,细胞壁再生,原生质体？P18,名词,五、工业微生物菌种的保藏,1、菌种保藏的目的 使菌种的生命得以延续并保持它们原有的生物学特性。在基础的研究中，可保证同一菌种在工作过程及工作结束后，均可获得重复的实验结果。对于有经济价值的生产菌，良好的保藏条件可保持其高产、高抗性等优良的性能。对于通过生物工程技术所得的重组菌，则需保持其遗传特性的稳定。,2、菌种保藏的基本原理 使根据微生物生理、生化特点，人工地创造条件，使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是低温、干燥、缺氧三方面，使菌株尽可能少发生突变，以达到保持纯

6、种的目的。,3、菌种保藏的具体方法斜面保藏法和穿刺保藏法 干燥保藏法悬液保藏法 冷冻干燥保藏法液氨保藏法 低温保藏法,六、菌种的扩大培养,.1）表面培养 表面培养是将纯种微生物接种在固体或液体培养基的表面的在恒温条件下进行静置培养的方法。2）固体培养 固体培养法是将纯种微生物接种在固体培养基上。,如实验室中进行的固体斜面培养、固体平板培养都是表面培养；进行液体培养时，若细胞在液面生长繁殖，形成一层膜状物，也为表面培养。表面培养的特点是生长在培养基表面上的微生物既能与空气接触吸收氧气，又能与培养基接触吸收营养。但是由于表面培养近于自然培养，因此存在生长缓慢，占用面积大，容易染菌等缺点，在大规模工

7、业生产中很少采用，仅在实验室或小试中用得较多。,1、微生物的培养方法,工业上常用大米、麸皮、米糠、谷壳、木屑等为基本原料，适当补充一些其他营养成分和水分，经灭菌后制成微生物培养基。固体培养基的特点是疏松，在培养基内部充满了空气，因此既可以静置培养，又可以通风培养。固体培养是介于表面培养和深层培养之间的一种培养方式，它的优点是设备简单，投资少，适合于小规模生产。缺点是占地面积大，劳动强度高，产品质量不太稳定。,.3）液体深层培养 液体深层培养又叫液体通风培养，菌体在液体培养基中处于悬浮状态，导入培养基中的空气通过气液界面传质进入液相，再扩散进入细胞内部。液体深层培养是在专门的发酵罐中进行的。,它

8、的优点是可以根据微生物在生长过程中对碳源、氮源、生长因子等营养物质及温度、PH值、需氧量等条件的不同需要，合理配制，补加各种营养物质和随时调节温度、PH值和通风量，这就有可能把微生物培养过程的生长、代谢都控制在最佳状态而收到最好的培养效果。,2、微生物的扩大培养,现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。,菌种扩大培养的目的：就是要为每次发酵罐的投料，提供相当数量的代谢旺盛的种子。,种子扩大培养的任务：不但要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛的、接种数

9、量足够的培养物。,种子扩大培养的过程：斜面菌种 一级种子培养 二级种子培养 发酵罐,因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，并且也有利于减少染菌的机会。,种子扩大培养流程图P25图2-2,实验室种子制备阶段（一级种子培养）,生产车间种子制备阶段（二级种子培养、三级种子培养）二级发酵 三级发酵,砂土孢子,冷冻干燥孢子,斜面孢子,摇瓶液体培养,茄子瓶斜面培养,固体培养基培养,一级种子罐,二级种子罐,发酵罐,种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发

10、酵罐的容积而定。对于生长快的细菌，种子用量少，故种子罐数相应也少。如谷氨酸生产，种子接入种子罐后于32C培养7-10h，菌浓达到108-109个/ml，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，种子接入一级种子罐27C培养40h后，再需移入装有新鲜培养基的第二级种子罐，于27C培养10-24h移至发酵罐作为种子，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。,种子罐的级数越多好还是越少好？,种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌的机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐最终代谢产物积累

11、的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。,问题1,问题2,什么叫接种龄？以什么接种龄接种较好？,指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常接种龄以菌丝处于生命极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体尚未达到最高峰时较为合适。对于年轻的种子接入发酵罐后往往会出现前期生长缓慢，整个发酵周期延长；过老的种子会引起生产能力下降而菌丝过早自溶。,问题3,什么叫接种量？以什么接种量接种较好？,指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。如大多数抗生素发酵的最适接种量为7%-15%，由棒状杆菌进行谷氨酸发酵的接种量只需用1%。采用较大的接种量可以缩短发酵

12、罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液粘度增加，造成溶解氧供应不足而影响产物的合成。,七、菌种退化及其防治,1、菌种退化的结果,使微生物个体和群体特征的各个方面发生变化，其中最重要的是使所需产物的生产产量下降、营养物质代谢和生长繁殖能力下降、发酵周期延长、抗不良环境条件性能减弱等。,菌种的退化不同于培养过程中由环境条件变化引起的表面的、暂时的变化，而是由个别、少数菌体细胞衰退后逐渐导致整个菌株退化的一个从量变到质变的遗传变异过程。,2、菌种退化的原因,菌种的退化是由于微生物细胞内的DNA 结构发生了变化，从而使由DNA决定的性状发生相应的变化。菌种的退化的

13、原因可归结为内因和外因两个方面，即自身变化和环境影响。,1）环境条件引起菌种退化,菌种连续传代是菌种发生退化的直接原因。使培养物常处于旺盛的生长状态、且每次传代时营养和环境条件都是在不断的变化。,2）菌种自身突变引起菌种退化,菌种的自发突变和回复突变是引起菌种自身变化的主要原因。微生物细胞在每一世代中的突变机率一般为10-8-10-9，保藏在0-4度时这一突变机率更小，但仍然不能排除菌种退化的可能。,名词,回复突变?,指变异菌株因遗传组成的自身修复，使原有的遗传障碍解除，代谢途径发生变化，从而恢复原有的特性，表现出原育种过程中已获得的优良性状的退化。“返祖”,3、菌种退化的防治,由于菌种的退化

14、将会引起发酵过程的产量急剧下降，一旦发生菌种退化，就必须采取有效的预防和防治措施，防止菌种的优良性能发生退化，同时若发现某些优良性状退化，应及时进行分离纯化，使生产菌种保持稳定的优良特性。,1）退化菌种的复壮,名词,菌种的复壮?,指已经退化的菌种中（淘汰）衰退的个体，使其恢复原来优良的特性。具体措施有：,A、配合一定的培养条件，对退化菌株进行单菌落或单细胞分离，淘汰退化的个体，纯化菌种；B、将芽孢杆菌的悬液加热至90处理数分钟，杀灭已退化的菌体，保留芽孢；再将芽孢或孢子进行传代，以淘汰退化的个体；C、提供特殊的培养条件，使环境有利于优良性状菌株的生长而不利于退化菌株的生长，从而淘汰已退化的菌株个体；D、将分离后得到的初筛菌株先保藏，再进行复筛考察，从中选出稳定性较好的菌种；E、同时应用上述方法的两种或两种以上的方法，会收到更好的复壮效果。,2）提供良好的环境条件,A、进行合理的传代B、采用优良的保藏方法 C、定期纯化菌种,斜面冰箱保藏法；石蜡油封藏法；砂土保藏法；冷冻干燥保藏法。,