【教学课件】第三章核酸技术.ppt
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1、第三章核 酸 技 术,核酸的分离和纯化核酸电泳染色体DNA电泳 DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制 DNA的连接PCR技术分子杂交技术 核酸序列的测定,第一节核酸的分离和纯化,一、一般程序 1、供体的核酸分离 供体细胞培养 收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA 分离细胞器 分离总RNA 分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性RNA 染色体DNA(组建基因组文库),2、载体DNA分离 载体DNA 感染或转染细胞(病毒型)转化细菌细胞(质粒型)分离病毒颗粒 培养转化细胞、收集菌体 病毒载体DNA分离与纯化 破碎细胞 质粒DNA分离与纯化 3、DNA片段的分离 DNA 限制酶切 凝
2、胶电泳分离 特定DNA片段的回收,4、质量评估 1)凝胶电泳 2)光密度值测定 3)限制酶切分析二、细胞裂解 1.酶法:利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体,然后加去垢剂使原生质体裂解。1)细菌:溶菌酶 2)酵母:蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等 3)丝状真菌:Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶 4)植物细胞:纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间,反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。,2.机械法 1)压力剪切法:French压力机,酵母细胞,细菌(芽孢和G+球菌除外)2)射击破碎法:Braun破碎机,搅切器(ble
3、nder),混合器(玻璃球 3)固体研磨法:将待破碎细胞与玻璃球(0.10.45mm)同时致冷,在未融熔前用研杵磨成粉末 4)反复冻融法 三、DNA的分离与纯化 1、供体DNA的分离与纯化 要求:尽可能地保持其高分子量,无其它污染物。1)基因组大小:,染色体细菌 33004200kb酵母 15,000 kb果蝇 1.28x105 kb人 3x106 kb植物 2x1051x108 kb 天花病毒 288 kb痘病毒 196 kb质体 几100以上kb,线粒体 藻类 线状 15kb酵母 环状 1978 kb植物 环状 100150 kb动物(扁虫到人)环状 1518 kb锥虫 网状 6000 k
4、b(幼体)短膜虫 网状 30,000 kb(幼体)(Kinetoplast),叶绿体双子叶植物 121(菠菜)154kb(豌豆)单子叶植物 151(玉米)182kb(浮萍)藻类 132(裸藻)191kb(衣藻),2)CsCl密度梯度离心上清液 加入固体CsCl与EtBr溶液 室温下超速离心(45,000rpm)16小时 穿孔取出DNA(320nm)异丙醇抽提溴乙锭 缓冲液透析除去残余CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀DNA 离心、洗涤、干燥*两种方法比较:CsCl法操作步骤少,分离DNA分子量大,耗财多,且需超速离心机。苯酚法耗时少,不需昂贵仪器,但操作步骤多,易使DNA分子断裂。若 小心操作,所获
5、DNA亦符合要求。*上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤.可溶与不可溶物分离:高速离心除去细胞碎片,保留上清液。.使蛋白质分离:苯酚抽提或超速离心.使RNA分离:RNase处理或超速离心.使DNA与其它可溶物分离,2.载体DNA的分离与纯化 1)质粒载体DNA的分离 关键:如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开 原理:质粒DNA比染色体DNA 小得多,在DNA抽提过程中,染色体DNA断裂成小片段(线状),质粒DNA仍保持超螺旋构型,方法:.超速离心:利用两种DNA分子的大小和空间构型.变性法:在变性条件下使染色体DNA变为单链,而质粒DNA仍保持环状结构,当变性条件发生迅速变化时,前者仍不
6、能复性,而后者又可回复到天然构型。变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于ss环状病毒DNA RF型的分离,质粒DNA的氯霉素扩增使用并不广泛(菌株和载体)2)噬菌体载体DNA的分离 纯净病毒颗粒 病毒载体DNA M13mp载体可采用质粒DNA的分离方法,二、RNA的分离与纯化 1.制备RNA的关键防止内外源RNase的作用 1)RNase的特点:抗酸抗碱,具很广pH作用范围;抗高温严寒(065均具活性);抗变性剂 2)解决办法:外源RNase高温,焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液(TrisHCl除外)和器皿,操作者带手套 内源RNase高温抽提,强蛋白质变性剂,RNase抑制剂
7、,蛋白酶K等 2.总RNA的制备 根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法:1)热苯酚抽提法 2)胍盐法:异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3)LiCl/尿素法,其中以胍盐法最好,对于从那些RNase含量很高的组织(胰脏)中提取RNA特别有效,可使RNase迅速变性,制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中,细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。,3.多聚核糖体RNA的制备 1)多聚核糖体的分离 超速离心法(30-40万g,离心2-3 h)镁盐沉淀法(0.1 M Mg+)分级分离法分离特异性多聚核糖体,i.结合与游离核糖体的分离,这种方法可避免溶酶体破裂。ii.核糖体大小分级分离,利用连续密度梯度
8、分离特大和特小的 多聚核糖体 iii.核糖体免疫沉淀法*直接免疫沉淀法 新生肽链+抗体 蔗糖密度梯度离心*间接免疫沉淀法 新生肽链+抗体+抗-抗体(二抗)不可 溶复合物 离心分离,*免疫亲和层析法 新生肽链-抗体复合物 不溶性交联抗原基 质亲和层析柱吸附 洗脱 免疫沉淀法优点:可分离到含量仅为1%的mRNA,但必须使用高纯度的抗体,不能发生交叉反应和污染核酸酶 2)多聚核糖体RNA的分离纯化多聚核糖体+SDS 蔗糖密度梯度离心或蛋白酶K-苯酚抽提 4.RNA的分级分离 1)分子量大小分级分离 i.蔗糖密度梯度离心 ii.凝胶电泳 2)核酸序列分级分离 i.分子杂交法:适用于同源性很高的RNA的
9、分离DNA分子变性 结合到NCF RNADNA杂交 洗涤 洗膜 乙醇沉淀,ii.亲和层析法:低聚dT纤维素:用于poly(A)较长的mRNA;多聚U琼脂糖:用于poly(A)较短的mRNA(20A)RNA进样吸附 洗涤 洗脱 收集260nm处吸收峰样品 乙醇沉淀 iii.无poly(A)mRNA的分离 纯化多聚核糖体 核糖体亚基+mRNP 离心 mRNP 蛋白酶K mRNA 低聚(dT)纤维素层析 洗出液 乙醇沉淀(无多聚A mRNA)5.RNA的质量评估方法 1)光密度值测定法 A260/A280=2.0 2)凝胶电泳 3)体外蛋白质翻译,第二节核 酸 电 泳,1.种类 1)按凝胶材料分:聚
10、丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼脂糖和低熔点琼脂糖)2)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶;竖式/聚丙烯酰胺凝胶 3)两种方法比较:分离效果和分离范围;操作难易 2.用途 琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规分析;聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。3.凝胶电泳的一般程序 制胶 点样 电泳 染色 观察二、DNA电泳 1.DNA分子种类 1)线状DNA单链与双链,ss-DNA电泳时要注意局部区域形成ds-DNA,造成迁移距离不确定 2)环状DNA单链(如M13mp)和双链(质粒DNA)3)线状ds-DNA电泳使用频率最高的一种电泳,这类DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响:i.分
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