【教学课件】第三十四章抗微生物药物和敏感性试验.ppt

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1、第三十四章抗微生物药物和敏感性试验,第一节 临床常用抗菌药物,抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。前者是真菌、放线菌、细菌等的代谢产物，后者是经化学改造的半合成抗生素和化学合成药物。,一、青霉素类抗生素：包括青霉素G、耐 青霉素酶青霉素、广谱青霉素等。二、头孢菌素类抗生素：包括第一代、第 二代、第三代头胞菌素。三、其他内酰胺类抗生素（一）单环内酰胺类抗生素，主要 有氨曲南和卡芦莫南。,（二）头霉素类和氧头孢烯类抗生素，主 要有头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑。（三）碳青霉烯类抗生素，主要有亚胺培南、米洛培南、必安培南、帕尼培南。（四）内酰胺类抑制剂，主要有克拉维 酸、舒巴坦和他唑

2、巴坦。,四、氨基糖苷类抗生素 按其来源分为：由链霉菌属发酵滤液提 取获得，有链霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；由小单 胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福 提霉素；半合成氨基糖苷类，有阿米卡 星、奈替米星、地贝卡星等。,五、喹诺酮类抗生素第一代为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶 酸和恶喹酸。第二代为广谱类抗生素，抗菌强度依次 为环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙 星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟 沙星。第三代为超广谱类抗生素，有司帕沙星、妥舒沙星、左氟沙星等。,六、大环内酯类抗生素，常用的有红霉素、柱晶白霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素。七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素（一）四环素为广谱抗

3、生素，抗菌活性 的顺序为米诺环素多西环素美他 环素地美环素。,（二）氯霉素类抗生素，包括氯霉素、甲砜霉素。（三）林可酰胺类抗生素，主要有盐酸 林可霉素、克林霉素。八、糖肽类抗生素，常用的有万古霉素 和替卡拉宁,九、磺胺类药物及增效剂分三类：用于全身感染的药物，分为短效、中效、长效三类，有磺胺甲恶唑，磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪；肠道起作用的药物有柳氮磺胺啶银、磺胺二甲氧嘧啶；局部应用的药物有磺胺米隆、磺胺 醋酰钠。,十、其他合成抗菌药（一）硝基呋喃类 用于肠道、尿路感染和 外用消毒，有呋喃坦啶和呋喃唑酮。（二）硝基咪唑类对厌氧菌有抗菌作用，对 需氧菌无效，有甲硝唑和替硝唑。,第二节 抗菌药物敏感性试

4、验（AST）,一、意义可预测抗菌治疗的效果，“敏感”治疗可能有效；“耐药”肯定失败；指导医生选择使用抗生素，AST的结果为“耐药”，即应更换药物；提供所选择药物的依据；监测耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药菌感染 病流行病学，控制和预防耐药菌感染发生和流行。,二、试验常规抗菌药物选择,在标准中分成A、B、C、U四组,A组所列的抗生素为常规首选药敏试验药物,B组为临床使用主要抗生素,尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使用：对A组同类抗生素耐药；标本来源不同时，如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶唑使用于尿道分离的细菌；多种微生物感染；多部位感染；感染流行的控制；对A组抗生素过敏

5、、耐受或无反应。,C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或对A组药物过敏的病人和某些不常见的细菌（如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠球菌）。U组仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道外分离菌的常规药敏试验。,(一）非苛养菌药敏试验抗生素的选用,A组一级试验并常规报告的抗微生物药,如葡萄球菌属用苯唑西林和青霉素。B组一级试验有选择报告的抗微生物药,如肠球菌属用万古霉素。C组补充试验有选择报告的抗微生物药，如葡萄球菌属用氯霉素。U组仅用于泌尿道的补充实验的抗微生物药，如葡萄球菌属用洛美沙星和诺氟沙星。,(二）苛养菌药敏试验抗生素的选用,A组一级试验并常规报告的抗微生物药,如肺炎链球菌用红霉素和青霉素。B

6、组一级试验有选择报告的抗微生物药,如肺炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲松。C组补充试验有选择报告的抗微生物药，如肺炎链球菌用头孢呋辛。,三、稀 释 法,琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。结果判断将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度（磺胺可见少许散在细菌生长）。试验菌的结果报告可用MIC（g/ml）或用敏感（S）、中介（I）和耐药（R）报告。,四、纸片琼脂扩散法,（一）试验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中

7、所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。,(二)培养基和抗菌药物纸片,1抗菌药物纸片 选择直径为635mm，吸水量为20l的专用药敏纸片用逐 片加样或浸泡方法使每片含药量达规 定所示。含药纸片密封贮存28 且不超过1周。2培养基 水解酪蛋白（MH）培养基是 兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培 养基，4保存。,（三）细菌接种 用05麦氏比浊标准的菌液浓度，在琼 脂表面均匀涂片,在15min内接种完毕。将含药纸片紧

8、贴于琼脂表面,35孵育 18h后阅读结果。（四）结果判断和报告 用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈 直径。根据NCCLS标准，作出“敏感”,“耐药”和“中介”的判断。,五、E 试 验,（一）原理 E试条是一条 5mm50mm的无孔试剂载体，一 面固定有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释 抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放 在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕 试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交 点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。,（二）细菌接种和加样 使用厚度为4mmMH琼脂平板，用05麦氏 浓度的对数期菌液涂布，待

9、琼脂平板完全 干燥，用E试验加样器将试条放在已接种细 菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧 密接触，试条MIC刻度面朝上浓度最大处靠 平板边缘。,（三）结果判断和报告 读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。与NCCLS的稀释法MIC参考值高度相关。,六、药物敏感试验结果解释,“敏感”即表示测试菌可被测定药物常规剂 量给药后在体内达到的血药浓度所抑制；“耐药”即表示测试菌不能被在体内感染部 位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临 床治疗无效。“中介”者提示该细菌对常规用药体液或组 织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使 用高于正常给药量有疗效。,七、联合药物敏感试验和杀菌试验,（一）意义目的在于：治疗

10、混合性感染；预防或推迟细菌抗生素耐 药性的发生；联合用药可以减少剂量以 避免达到毒性剂量；联合用药比单一用药时效 果更好。,出现4种结果：无关作用小，两种药物联合作用的活性 等于其单独活性；桔抗作用，两种药物联合作用显著低于 单独抗菌活性；累加作用，两种药物联合作用时的活性 等于两种单独抗菌活性之和；协同作用，两种药物联合作用显著大于 其单独作用的总和。,协同作用发生原理联合用药的抗菌药物在不同部位抑制细 菌细胞壁合成或封闭细菌的新陈代谢；内酰胺类抗生素增加了氨基糖苷类 药物进入细菌细胞；联合用药的抗菌物之一是抑制内酰 胺酶活性的药物。联合用药时，必须做联合抗菌药物敏感 性试验。,（二）联合抑

11、菌试验,棋盘稀释法是常用的定量方法，首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的MIC。药物最高浓度为MIC的2倍，对倍稀释。两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。接种菌量为5105CUFml，35孵育18h后观察结果。计算部分抑菌浓度（FIC）指数。,FIC指数 0 5为协同作用；051为相加 作用；12为无关作用；2为拮抗 作用。,（三）最低杀菌浓度测定,MBC是指能杀灭999以上测试菌量的最低药物浓度，常规测试的方法包括培养基、药物稀释、细菌悬液接种等，与MIC测定法相同。,八、监控抗生素的治疗效果试验,（一）血清抗菌药物浓度测定 血清

12、抗菌药物浓度和抗菌药物疗效密切相 关，为保证感染组织中有效浓度，血药浓 度应该达到致病细菌MIC2倍以上。但某些 抗生素治疗浓度和中毒浓度相近，过高的 血药浓度引起毒性反应，因而监测血清抗 菌药物浓度十分重要。,微生物测定法,与琼脂扩散法原理相似。用已知含药浓度 的纸片加到混有一定指示菌悬液浓度的倾 注平板表面，35孵育1620h，量取抑菌 圈直径。以抑菌圈直径为横坐标，含药浓 度为纵坐标，画出标准曲线。然后在标准 曲线找出体液测试的抑菌圈直径相应的含 药浓度。,（二）血清抗菌活性测定,体内抗菌药物活力的测定方法即为抑菌 力和杀菌力测定，称为血清杀菌活力试 验。本法是取感染患者血液分离的血清对

13、感 染部位分离确证的病原菌的抑菌和杀菌 能力，为供临床现用抗菌药的疗效考核 评价以及感染预后的判断提供实验依据。,采用体外抑菌试验和体外杀菌试验。无肉眼可见菌生长的血清最高稀释管代表患者血清的抑菌力，其菌落计数等于或小于0.1最初接种菌量的血清最高稀释管代表患者血清杀菌力。血清抑菌力杀菌力1：8常提示治疗方案有效。,九、自动化仪器检测,ViterATB系统和Microscan是半自动或全自动细菌鉴定和药敏系统，通过系统中药敏专家系统可报告分离菌的药敏结果。,第三节 细菌耐药性和产生机制,一、细菌的耐药性 对某种抗菌药物敏感细菌变成对该药 物耐受称细菌耐药性。它可分为天然耐 药和获得性耐药，前者

14、是通过染色体DNA 突变而致，后者往往是由质粒。噬菌体 及其他遗传物质携带外来DNA片段导致产 生的耐药性。,突变可由细菌自发产生或在X线等物理因素或化学物质诱导产生，一般只对一种或两种相似药物耐药，在细菌耐药性上不占主要地位。接合型质粒通过接合方式，非接合型质粒通过转化。转导、转换形式产生耐药。,二、细菌耐药性的生物化学机制,1.产生内酰胺酶，水解药物内酰 胺环而失去抗菌活性。2.产生钝化酶使抗生素失活，钝化酶有三类：氨基糖着类钝化酶；氯霉素乙酸转移酶；红霉素酶和其他灭活酶。,3.青霉素结合蛋自改变导致对抗生素的 亲和力下降。4.药物作用靶位的改变使抗生素不易结 合产生耐药性。5.抗菌药物渗

15、透障碍，如外膜蛋白减少 和药物外排作用等。6.代谢途径的改变。,第四节 细菌耐药性检查方法,一、细菌耐药性表型检测 某些特殊菌耐药表型检测的方法：（一）琼脂筛选试验 以单一药物单一浓度检测耐药性称耐药筛选试 验，临床上常用于对耐甲氧西林葡萄球菌、耐 万古霉素肠球菌，对庆大霉素或链霉素高水平 耐药的肠球菌。在含一定浓度测试药物的特殊 培养上，点种05麦氏比浊度直接菌落配制细 菌悬液，35孵育24h后观察平板上是否有菌 落生长识要有1个菌落生长，均视为耐药。,（二）折点敏感试验,仅用特定抗生素浓度（敏感、中介或耐药折点MIC）而不使用测定MIC时所用系列对倍抗生素浓度测试细菌对药物的敏感性称折点敏

16、感试验。当选择区分中介和耐药折点值药物浓度时，若两种抗药物浓度培养基均生长可判断为耐药；如在两种药物浓度均不生长则为敏感；仅在较低药物浓度培养基中生长提示为中介。,（三）双相纸片试验,挑取在血平板上菌落，稀释成05 麦氏浓度菌液。均匀涂布于 MH平板。中央贴上阿莫西林/克拉维酸纸片，在距该纸片25mm处分别贴头孢噻肟或头孢曲松、头孢他啶和氨曲南等药敏纸片作为指示剂，35孵育18h观察结果。若指示剂在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大的现象（协同现象），则说明待检菌产生超广谱内酰胺酶。,（四）自动化仪器,自动化仪器Microscan有测定抗菌药物抑菌的MIC值功能。原理是先测定细菌对抗生素的

17、MIC值，当头孢他啶与头孢他啶十克拉维酸的MIC比值或头孢噻肟与头孢噻肟十克拉维酸的MIC比值大于或等于8（即3个对倍稀释度）即判定为此细菌产生ESBL。,二、内酰胺酶检测,1.头孢哨噻吩滤纸片法 用接种环挑取受试菌于商品化头孢哨噻 吩滤纸片上，于10分钟内由黄色转变为 红色即阳性结果，示产色头孢菌素的 内酰胺环被酶打开。,2.碘淀粉测定法 用接种环挑取受试菌混于青霉素溶液中，室温下振摇30分钟。加入淀粉液后，再加 入碘液，溶液变蓝，继续振摇。若检测菌 产生酶，则可水解青霉素内酰胺环变 为青霉素噻唑酸，后者与碘结合，使碘淀 粉复合物转变为无色，10分钟之内蓝色消 失者为产酶株。,三、耐药基因检

18、测（一）常见的耐药基因举例,（二）耐药性基因检测方法,1.PCR 扩增目标DNA，用琼脂糖电泳，探 针杂交技术或DNA序列测定确定扩增子，标准PCR扩增再用琼脂糖电泳分析扩增 子的大小。或用标记探针杂交RFLP分析 或 DNA序列测定确定扩增子。,2.PCRRFLP分析,即限制性片段长度多态性分析。扩增后的DNA用内切酶消化，由于碱基组成不同，而产生不同长度的酶切片段，再经琼脂糖电泳，就可反映出基因组DNA碱基序列组成与已知耐药基因序列是否存在差异。,3PCRSSCP分析,即单链构象多态性分析。PCR扩增后DNA变性形成单链，然后电泳，单链核苷酸在聚丙烯酸胺凝胶中电泳的迁移率与核苷酸的空间构型

19、密切相关。若单链核苷酸的序列发生突变，甚至是当个碱基的变化，其空间构型都有不同，电泳迁移率也不同。,4PCR线性探针分析,依据耐药基因，设计包含常见突变位点的不同寡核苷酸探针（R探针），同时设计该基因的正常序列的探针(S探针），分别固定在硝酸纤维素膜上，与待检株PCR扩增产物以平行线方式杂交。杂交后显色，若扩增产物与S探针杂交阴性，与R探针杂交阳性，则为耐药株，反之为敏感株。,5生物芯片技术,是由固定于不同种类支持介质上的高密度的寡核苷酸分子、基因片段或多肽分子的微阵列组成生物芯片。当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后，可通过激光共聚焦荧光扫描或电荷偶联摄像机对荧光信号的强度进行检测，从

20、而对杂交结果进行量化分析。,6自动DNA测序,PCR扩增待测基因后，扩增产物可直接测序，并准确判定碱基突变的位点。,四、特殊耐药菌检测,（一）耐甲氧西林葡萄球菌检测1定义 1g苯唑西林纸片的抑菌圈直径 10mm，或其MIC4gml的金黄色 葡萄球菌。对1g苯唑西林抑菌圈直径 17mm，或MIC 05gml的凝固 酶阴性葡萄球菌称耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。,2临床意义,MRS不论其体外药敏试验结果，所有的内酰胺类药物和内酰胺内酰胺酶抑制剂均无临床疗效；绝大多数的MRS常示多重耐药，包括氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类。,（二）耐青霉素肺炎链球菌检测,1.定义 当对1 gml苯唑西林纸片抑菌

21、圈20mm或MIC006 gml互应视 为耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）。2.临床意义PRSP对氨苄西林、氨苄西林 舒巴坦、头孢克肟、头孢唑肟，临床治 疗的疗效很低。但应检测对头孢曲松、头孢噻肟和美咯培南的MIC以判断是否对 这些抗生素敏感。,（三）耐万古霉素肠球菌检测,1定义 对 30g万古霉素纸片抑菌圈直 径 14mm或其 MIC32gml应视 为耐万古霉素肠球菌（VRE）。2临床意义 对青霉素敏感的VRE可用青霉 素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐 药而不是高水平耐氨基糖苷类可用壁霉 素庆大霉素。,（四）超广谱内酰胺酶肠杆菌科细菌检测,1定义 超广谱内酰胺酶是水解青霉素、头孢菌素及单胺类

22、的酶，主要由克雷伯菌 和大肠埃希菌、肠杆菌等细菌产生。,当通过筛选法时对头孢泊肟、头孢他啶（10ug 片）抑菌圈 22mm或氨曲南、头孢噻肟（30 ug片）27mm的菌株经头孢他啶（30ug片）、头孢他啶克拉维酸（3010ug）；头孢噻肟30ug、头孢噻肟克拉维酸（3010ug）二组确证试验。,其结果为二组中任何一组药物，加克拉 维酸与不加克拉维酸的抑菌圈相比，增 大值35mm时即判定为产ESBL菌株。2临床意义 产ESBL克雷伯菌和大肠埃希 菌不论其体外药物敏感试验结果如何，对青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无 效。,第五节 抗分枝杆菌药物敏感性试验,一、抗分枝杆菌药物 第一线药物为异烟、利福平

23、、吡酸胺、乙胺丁醇和链霉素；第二线药物包括对氨基水杨酸、乙硫异 烟胺、环丝氨酸、卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素和利福布丁。,二、结核分枝杆菌和缓慢生长分枝杆菌体外抑菌试验,（一）结核分枝杆菌体外药敏试验指征 首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于合理用药和监测药物敏感性。另外经过三个月正规治疗，标本分离培养仍为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性结核病和结核性脑膜炎）以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外药敏试验。,（二）体外药敏试验方法,由于分枝杆菌生长缓慢，在分枝杆菌生长前，药物已扩散至培养基中，不能有效影响其生长。故常规用于需氧或兼性厌氧菌的药敏试验方法不适用结核分枝杆菌。有比例法、放

24、射同位素法、绝对浓度法、和耐药率法等四种方法。,1培养基Middlebrook7H10琼脂添加油 酸、白蛋白、葡聚精触酶是慢生菌比 例法的推荐培养基；2药敏试验药物 抗菌药物直接来自厂商，不能用治疗的抗结核药物作为试验用 药。药物原液浓度至少为1000g/ml，20贮存期6个月。,3细菌接种,直接比例法药敏试验采用涂片阳性患者标本；接种物是充分消化、无杂菌污染的标本,接种菌液的稀释方法如下：抗酸染色（1000）未见细菌，荧光染色（450）25，菌液不稀释。抗酸染色（1000）l10，荧光染色（450）25250，菌液稀释或 101，102。,观察含药琼脂格细菌生长情况用以4 表示：（：5010

25、0个菌落；2：100200个菌落；3：200500个菌落；4：500个以上菌落）。若测试菌生长数大于对照格菌落数1，即判读为耐药菌。,6质量控制,结核分枝杆菌 H37RV ATCC 27294为一线、二线药的敏感质控菌株；H37RV ATCC35820为链霉素耐药质控菌株；H37RV ATCC35822为异烟耐药质控菌株；H37RV ATCC35826为环丝氨酸耐药质控菌株；H37RV ATCC35827为卡那霉素耐药质控菌株；,三、快速生长分枝杆菌体外药敏试验,快速生长分枝杆菌是在合适的固体培养基上孵育57天内能肉眼可见细菌菌落生长。人类感染密切相关的有3种：偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟分枝亚

26、种和脓肿亚种。药物敏感试验操作方法基本同需氧和兼性厌氧菌。,第六节 厌氧菌体外抑菌试验,由于厌氧菌感染系内源性感染，厌氧菌药物敏感性稳定，一般不做体外药敏试验。下述情况应考虑药敏试验：明确厌氧菌引起的严重感染；已确证的厌氧菌感染，经验性的选药治疗未能奏效；需长期用药的厌氧菌感染。,厌氧菌体外药敏试验的基本原理和方法与需氧菌相同，只是在培养基、操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。培养基为布氏血琼脂再加人补充剂 5g/ml氯化血红素,5脱纤维羊,1g/ml Vit K。厌氧孵育条件，质控菌株为脆弱类杆菌ATCC25285。,第七节 抗真菌药物敏感性试验,一、抗真菌药物 分成三类：多烯类

27、抗生素，如两性霉素B、制 霉菌素、曲古霉素等；毗咯类，包括酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、克霉唑、益康唑等；其他类，如氟胞嘧啶。,二、抗真菌药物敏感性试验,设计操作同抗菌药物敏感性试验，原则为：提供两种以上有相当活性的抗 真菌药物的可信测量方法；和体内的活性具有相关性，可 预测治疗的效果；可用来监控敏感群体菌株耐药 性发生；可预期研究新药的潜在治疗效能。,抗酵母菌的药物敏感性试验,1培养基 含谷氨酸胺和PH指示剂、不含碳酸氢钠，RPMI 1640为试 验用的培养基。2.药物原液配制 来自药厂，不能 使用临床应用的药物，原液10倍 于最高试验浓度，60贮存。,3接种菌液制备 沙氏琼脂培养基35 孵育24h,传代两次，保证纯种，以 RPMll640稀释成2103CFUml。药 液对倍稀释为试验时用量。4.试验时应有生长对照和阴性对照。,5.结果判断 观察各管（孔）生长情 况。二性霉素B的MIC为抑制测试菌 肉眼可见生长的最低药物浓度。5FC 和吡咯类通常采用 80MIC判断标准。6.质量控制 采用标准菌株作为每次测 定质控菌株，其MIC应在预期值范围 内（g/ml）。,