荧光光谱.ppt

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1、荧光分析法,荧光分析的基本原理荧光定量分析方法荧光分析仪器与技术,荧光分析法,荧光分析法概述,光致发光：吸收某种波长的光后发射出比吸收波长更长的光的现象。,荧光分析法(fluorormetry),荧光光谱定性分析荧光强度定量分析,荧光分析的分类,分析对象,激发光波长范围,(荧光和磷光),原子荧光分析分子荧光分析,紫外-可见荧光分析红外荧光分析X射线荧光分析,荧光分析法与紫外-可见分光光度法的主要区别,紫外光,I0,I,AC,F,(S=10-910-12g/ml),样品溶液,UV-vis,(S=10-610-7g/ml),FC,荧光分析法,荧光分析法概述（续前）,平行于入射光,垂直于入射光,优点

2、：灵敏度高,（吸收）,（发射）,荧光分析法的基本原理,分子荧光的产生原理荧光物质分子的光谱特征荧光强度及其影响因素,单重态与三重态,单重态(siglet state,S)：总自旋量子数s=1/2+(-1/2)=0;多重性M=2s+1=1,基态(S0),三重态(triplet state,T)：s=1/2+1/2=1；M=2s+1=3,激发单重态(S),激发三重态(T),激发态分子返回基态的途径,振动弛豫(vibrational relexation)内部能量转换(internal conversion)荧光(fluorescence)发射外部能量转换(external conversion)体

3、系间跨越(intersystem crossing)磷光发射,激发态基态途径（图）,吸收,振动弛豫,S1*(V=n),S1*(V=0),非辐射,10-12s,内部能量转换（内转换）,激发态分子返回基态的途径（续前）,S1*(V=n),S2*(V=0),非辐射,E很小,荧光发射,S1*(V=0),S0(V=n),Sn*(V=n),内转换,振动驰豫,辐射,荧光：物质分子接受光能激发后，从第一电子激发态最低振动能级返回基态时发射出的光。,外部能量转换（外转换）,S1*(V=0),S0(V=n),碰撞转移能量,热平衡过程,S1*(V=0),T1*(V=n),非辐射,激发态分子返回基态的途径（续前）,磷

4、光发射,体系间跨越,体系间跨越,S1*(V=0),振动驰豫,Sn*(V=n),内转换,S0(V=n),辐射,T1*(V=0),（10-410s）,T1*(V=n),振动弛豫,T1*(V=n),S1*(V=0),非辐射,荧光和磷光的主要区别,单重态单重态,激发光停止照射荧光立即消失,三重态单重态,激发光停止照射磷光仍将延续一段时间,激发光谱与发射（荧光）光谱,激发波长,发射波长,荧光物质分子的两个特征光谱,激发光谱(excitation spectrum)：F ex,荧光光谱(fluorescence spectrum)：F em,硫酸奎宁的激发光谱及荧光光谱,激发光谱,荧光光谱,荧光光谱的特征

5、,斯托克斯位移(Stokes shift),荧光发射波长总是大于激发光波长,荧光光谱的形状与激发波长无关,激发：S0(V=0)Sn*(V=n)荧光：S1*(V=0)S0(V=n),荧光光谱与激发光谱呈镜像关系,蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）,荧光光谱,S0S2*激发光谱,S0S1*激发光谱,激发光谱：S0(V=0)S1*(V=1,2,3,4)荧光光谱：S1*(V=0)S0(V=1,2,3,4),蒽的能级跃迁,荧光光谱的特征（续前）,荧光寿命和荧光效率,荧光寿命(fluorescence lift time,f)：当激发光停止照射时，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时

6、间。,荧光物质的两个重要发光参数,指数衰减定律：Ft=F0e-Kt(K：衰减常数),t=fFt=(1/e)F0,Ft/F0-t作图直线斜率=1/f f=1/斜率,荧光效率(fluorescence efficiency)荧光量子产率(fluorescence quantum yield),物质分子能发射荧光的两个必要条件,有强的紫外-可见吸收有一定的荧光效率,n*,共轭双键，K带强吸收，荧光效率高，荧光强度强。,弱吸收，体系间跨越几率大，荧光较弱，意义不大。,有机化合物分子结构与荧光的关系,长共轭结构,（芳香环、稠环或杂环）,共轭系统 f ex、em,ex=327nm，em=510nm,稠芳环

7、分子的几何排列对荧光的影响,含有长共轭双键的脂肪烃,分子的刚性和共平面性,共轭系统的刚性和共平面性f,联苯f=0.2 芴f=1.0,金属离子络合增加分子刚性和共平面性,8-羟基喹啉 8-羟基喹啉镁,位阻效应和立体效应 f,1-二甲氨基萘-7-磺酸盐 1-二甲氨基萘-8-磺酸盐,f=0.75 f=0.03,位阻效应,取代基,供电子基：NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN f，F吸电子基：-NO2、-COOH、-NHCOCH3、-C=O、-NO、-SH、-X f，F，甚至荧光熄灭-R、-SO3H、-NH3+对f 无影响,影响荧光强度的外界因素,温度,TF,溶剂,极性fF粘度分子间碰撞几率F含

8、重原子(CBr4、CH3CH2I)F形成氢键S1*(V=0)分子F,pH值,pH13,弱酸、弱碱,兰色荧光,荧光熄灭剂,荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。,荧光熄灭剂(quenching medium)：引起荧光熄灭的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。,引起荧光熄灭的原因,碰撞损失能量作用不发光物质重原子Br/I体系间跨越三重态溶解O2荧光物质氧化/O2顺磁性体系间跨越三重态荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分子间碰撞几率而产生

9、的荧光熄灭现象。(浓度限量1g1mg/ml),荧光熄灭法(fluorescence quenching method)：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。,种类瑞利光(Reyleigh scattering light)：弹性碰撞，不发生能量交换，仅改变光子运动方向，波长及频率不变。拉曼光(Raman scattering light)：非弹性碰撞，发生能量交换，光子的运动方向和波长、频率均发生改变。,较长拉曼光干扰荧光测定。,散射光,散射光(scattering light)：由于光子与物质分子相互碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。

10、,硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b),荧光光谱,拉曼光谱,瑞利光320nm,拉曼光360nm,拉曼光400nm,荧光448nm,激发320nm,激发350nm,瑞利光350nm,荧光定量分析,荧光定量分析的依据F与C的关系荧光定量分析方法荧光分析法与UV-vis定量分析的区别,荧光强度F与浓度C的关系,溶液的荧光测定,激发光源垂直方向,荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。,F=K(I0I),(I=I010-ECl),=K(I0-I010-ECl)=KI0(1-10-ECl)=KI0(1-e-2.3ECl),太劳极数展开式：ex=1+x/1！+x2/2！+x3/3！

11、+,ECl0.05,F=2.3KI0ECl=KC,荧光分析法仅适用于稀溶液的测定满足定量分析条件：ECl0.05FC降低荧光自熄灭（内部猝灭）作用灵敏度高（放大信号）,F与C的关系推导（续前）,荧光定量分析的依据,荧光分析法与UV-vis灵敏度差异,紫外-可见分光光度法定量依据：AC 检测信号：A=-lg(I/I0)=ECl CI0/I1A0,荧光分析法定量依据：FI0及C 检测信号：F=2.3KI0ECl CF,放大信号（检测灵敏度）,I0F荧光分析灵敏度高,放大信号I0，I,I/I0不变UV-vis灵敏度受限，不如荧光分析,(S=10-610-7g/ml),(S=10-910-12g/ml

12、),荧光定量分析方法,校正曲线法(FC),荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别,T=0，A=,关闭光闸，光不透过，全吸收,T=100%，A=0,空白溶液，光全透过，不吸收,F=0,空白溶液，不发射荧光,F=100%,对照品溶液Cmax,F=50%(Cmid),比例法,荧光定量分析方法（续前）,适用：校正曲线过原点,多组分混合物测定,原理：荧光强度的加和性方法：解联立方程,空白调零降低测定的灵敏度：仪器调零 F0Fs和Fx扣除空白(Fs-F0、Fx-F0)计算。,荧光分析仪器与技术,荧光分析仪器类型、主要部件和校正荧光分析新技术荧光分析的应用,荧光分析仪器类型,滤光片荧光计分光系统：

13、激发滤光片（带通型）发射滤光片（截止型）用途：可用于定量分析；不能测定光谱,滤光片-单色器荧光计分光系统：激发滤光片+发射光栅用途：可用于测定荧光光谱及定量分析；不能测定激发光谱，,930型荧光计光路示意图,激发滤光片,发射滤光片,荧光分析仪器类型（续前）,荧光分光光度计,荧光分光光度计结构示意图,分光系统：光栅用途：测定激发光谱、荧光光谱及定量分析。,最大激发波长exmax和最大荧光波长emmax是鉴定物质的依据和定量测定时最灵敏的条件。,激发单色器,发射单色器,荧光分析仪器类型（续前）,荧光分析仪器的主要部件,激发光源：汞灯、氙灯、氘灯、溴钨灯分光系统：滤光片；单色器（光栅）样器池：低荧光

14、材料或石英材料，四面透光检测器：紫外-可见（光电倍增管）,荧光分析仪器的校正,灵敏度校正：对照品溶液Cmax F=100%Cmid F=50%硫酸喹啉:0.001g喹啉标准品硫酸(0.05mol/L)C=1g/ml波长校正：汞灯标准谱线激发光谱与荧光光谱的校正单光束：调整光源强度一致双光束：参比光束抵消光学误差,荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别,入射光与吸收光同方向,入射光与荧光垂直方向,两种光源(紫外+可见),一种光源(紫外),空白溶液(F=0)荧光对照品溶液(F=100%或50%),空白溶液(T=100%),紫外无吸收两面透光,低荧光材料四面透光,荧光分析新技术,激光荧光分析,时间分辨

15、荧光分析(time-resolved fluorometry),原理：激发和检测之间延缓一段时间，具有不同荧光寿命的物质分别检测激发光源：脉冲激光优点：检测时排除干扰，无需化学预处理,激发光源：波长更短、强度更大的激光优点：提高灵敏度(样品量1l或10-1610-14g)和专一性用途：生化样品、气体样品及有机化合物的自由基,同步荧光分析,原理：=exmax-emmax同步荧光光谱 同步信号Fsp(ex,em)=KCFexFem用途：多核芳香族化合物,荧光分析新技术（续前）,胶束增敏荧光分析,原理：胶束溶液的增溶、增稳、增敏作用优点：提高荧光物质溶解度、稳定性及灵敏度 胶束溶液：一定浓度(临界胶

16、束浓度CMC)的表面活性剂溶液,亲水基,疏水基,荧光分析的应用,有机化合物的荧光分析,研究对象：芳香族及具有芳香结构的化合物,有机化合物：多环胺类、萘酚类、嘌啉类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质药物：生物碱类(麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱)；甾体类(皮质激素及雌醇)；抗生素类(青霉素、四环素)；维生素类(维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗坏血酸、叶酸及烟酰胺)中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）,荧光试剂,荧光胺,荧光条件：ex=275、390nm，em=480nm,适用：脂肪族和芳香族伯胺,吡咯啉酮,荧光胺,邻苯二甲醛(OP

17、A),适用：伯胺类、-氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸）荧光条件：ex=340nm，em=455nm(2-巯基乙醇存在，pH910的缓冲溶液),3.1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯),适用：伯胺、仲胺及酚基的生物碱类荧光条件：ex=365nm，em=500nm丹酰肼(Dansyl-NHNH2)：可的松等的羰基,荧光试剂（续前）,无机化合物的荧光分析,测定方法：与具有电子共轭结构的有机化合物形成荧光配合物研究对象阳离子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、

18、Zn、Zr阴离子：CN-、F-与Al、Zr离子强烈配合原有荧光配合物的荧光减弱甚至熄灭,荧光分析应用（续前）,1、乙醛酸含量的测定 与间苯二酚反应，产物发绿色荧光，ex:490nm；em:530nm 检测范围：0-0.4g/ml,2、葡萄糖含量的测定 与5-羟基-1-萘酮反应，产物苯并萘二酮发荧光，ex：365nm；em：532nm，2-20g/ml,3、用于蛋白质分子构象的测定 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等发荧光，ex：280nm。,4、蒽衍生物与铜离子相互作用的荧光光谱研究,5、对映体对映选择性识别的荧光光谱研究,课后练习,名词解释：荧光、弛豫振动溶液荧光光谱有哪些特征？能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？,