蛋白质的四级结构.ppt

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1、四 蛋白质的四级结构(quaternary structure),是指亚基间的空间排布、亚基间相互作用与接触部位的布局，不包括亚基本身的空间结构。亚基间以次级键相连，绝无共价键,1.概念,蛋白质分子由两条或两条以上肽链组成，每条肽链各自形成了独立的三级结构，分子中的每一个具有独立三级结构肽链,称为亚基,亚基(subunit),2.维持蛋白质四级结构的作用力,主要是疏水作用,次级键,盐键、氢键,第三节 蛋白质结构与功能的关系,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,以124个氨基酸残基组成的牛胰核糖核酸酶（4对二硫键）为例说明,牛胰核糖核酸酶的变性与复性,-巯基乙醇,尿素

2、或盐酸胍,透析,有活性,无活性,1.一级结构相似的蛋白质功能相似一级结构不同的蛋白质功能不同,胰岛素的一级结构及种属差异,（二）一级结构与功能的关系,ACTH 促肾上腺素皮质激素,MSH 促黑激素,一级结构不同的蛋白质功能不同,HbS与HbA的区别,-亚基第6位氨基酸,正常人：Glu,患者：Val,由4个亚基组成,血红蛋白,功能:运输O2,二、蛋白质空间结构与功能的关系,（一）肌红蛋白Mb与血红蛋白Hb,蛋白质的空间结构决定生物学功能,肌红蛋白（1个亚基）与血红蛋白（4个亚基）且一级结构有较大差异，但均具有与氧可逆地结合的能力,其结构特点是，都与血红素（辅基）共价结合,O2,O2,（二）血红蛋

3、白构象变化与结合氧的能力,变构效应,蛋白质分子与它的配体结合后构象发生变化,其功能也随之变化的现象,称为变构效应,协同效应,蛋白质分子中的1个亚基与其的配体结合后,能影响其它亚基与配体的结合,称为协同效应,促进,正协同效应,抑制,负协同效应,血红蛋白与氧结合的正协同效应,氧饱和度,静脉血,动脉血,氧分压,P50,100%-,Hb,Mb,第四节 蛋白质的理化性质,一、蛋白质的理化性质,（一）两性解离和等电点,蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的pH值,+OH-,+H+,+OH-,+H+,pH=pI,pHpI,pHpI,此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI),等电点（pI）：

4、在某一pH值溶液中，,蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当,蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零,蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间,属胶体颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体,蛋白质的胶体原因：,表面形成水化层,表面同种电荷的斥力,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质的聚沉,（三）蛋白质的变性、沉淀与凝固,变性后的蛋白称为变性蛋白质,1.蛋白质的变性作用,在某些理化因素作用下.蛋白质的构象被破坏，失去其原有的性质和生物活性，称为蛋白质的变性作用(denaturation),概念:,常见的变性因素：,强酸、,强碱、,有机溶剂、,尿素、,胍、,重金属,生物碱、,化学因素,物理因素,剧烈振荡,热、,

5、紫外线、,超声波、,变性蛋白质的主要特征:,（2）生物活性丧失,（4）变性蛋白质容易消化,（1）蛋白质分子中的次级键断裂,构象破坏，但不涉及共价键的破坏,一级结构不变,（3）变性蛋白质的溶解度常降低、粘度增加、扩散系数减小,除去变性因素后，有的变性蛋白质又可恢复其天然构象和生物活性，这一现象称为蛋白质的复性,蛋白质的复性(renaturation),当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。,蛋白质的沉淀(pre-cipitation),概念:,应用:,(1)蛋白质分离纯化,(2)解毒,(3)临床检验,(1)盐析法(salting o

6、ut),向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析,常用的中性盐：,不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性,硫酸铵、,硫酸钠、,氯化钠等,使蛋白质沉淀的方法,概念：,特点：,作用原理:,盐离子与水亲和力极强，,夺去蛋白质的水化层，减少分子间静电斥力,(2)有机溶剂沉淀法,使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀,必须在低温下操作,注意事项:,尽量缩短处理的时间,及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去,甲醇、乙醇、丙酮,缺点：,原理:,常用有机溶剂:,常会使蛋白质变性,重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带

7、负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀,(3)重金属盐沉淀法,此法常使蛋白质变性失活,若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生,缺点：,原理:,生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)，与带正电的蛋白质 结合生成不溶性的盐而沉淀,(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法,反应溶液的pHpI，确保蛋白质以阳离子形式存在,缺点：,原理:,常引起蛋白质变性,注意事项:,3.蛋白质的凝固作用,蛋白质的凝固作用实际上是蛋白质变性后进一步发展的不可逆结果,如加热可使蛋白质变为不容再溶解的凝块,二、蛋白质的分离纯化,(一)盐析和有机溶剂沉淀,(二)电泳,(三)透

8、析和超滤,(四)层析,(五)超速离心,分类：根据支持物的不同，电泳电泳可分为：薄膜电泳、凝胶电泳,（二）电 泳,概念：带电颗粒在电场中向着所带电荷相反 方向移动称为电泳。,原理:不同的蛋白质的因结构、形状和带电 量的不同而有不同的泳动速度，从而 达到分析和分离蛋白质的目的,应用：电泳技术是生化常用分析技术之一,利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质留在膜上，称为超过滤,将蛋白质溶液放在半透膜的袋内，置于流动的适当的缓冲液（如纯水）中，小分子杂质（如硫酸铵、氧化钠等）从袋中透出，而蛋白质保留于袋中从而将蛋白质纯化，这种方法称为透析,（三）透析,透析工作图,半透

9、膜原理,层析种类：凝胶过（分子筛）离子交换层析（阴离子和阳离子）亲和层析,(四)层析,带正电荷多蛋白紧密结合,带负电荷多蛋白流过层析柱,阳离子交换树脂工作示意图,分子筛层析,亲和层析工作示意图,蛋白质,载体介质,配体,结合,洗脱,洗脱介质,(六)超速离心,三、多肽链中氨基酸的顺序分析,第一步：分离提纯蛋白质，测定NH2末端的数目，确定蛋白质分子是 由几条肽链构成的，并分离出 每条肽链。测定肽链的分子量,计算组成该肽链的氨基酸残基数。及每种aa的百分组成。,一般过程：,肽链分子中氨基酸残基数=肽链的分子量120（各种的氨基酸残基的平均分子量为120）,再将肽链彻底水解，用离子交换层析法将各种的氨

10、基酸分离,a.丹磺酰氯法 丹磺酰氯是一种强荧光剂，它能专一地与链N-端-氨基反应生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定出N-端是何种氨基酸。,第二步 测定肽链的氨基末端和羧基末端,1.N末端的测定,b.二硝基苯氟法：过时,2.C末端的测定,常用羧基肽酶法,羧基肽酶专一地将肽链水解成片断，分别进行顺序分析,第三步 肽链的局部水解,胰蛋白酶的作用原理,1.酶解法,CNBr与Met反应测定Pr的一级结构,2.化学法,层析鉴定就可N-端开始确定被测肽段的氨基酸排列顺序,第四步 肽段氨基酸顺序分析,一般采用 Edman降解法,弱碱条件,异硫氰酸苯酯,+,N

11、端-氨基,苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽）,酸性条件,环化,水解,苯乙内酰硫氨基酸(PTH-aa),失去原N-端氨基酸的肽,剩下的肽可反复进行上述处理，依次生成各种PTH-aa，,Edman降解法的示意图,一般常用多种方法使肽链断裂，并分析出各肽段中的氨基酸顺序。由于在不同部位断链，只要找出多套肽段的重叠部位，然后组合排列对比，即可推断肽段的排列顺序，从而得出完整肽链中氨基酸的顺序,第五步 肽链一级结构的确定,则其氨基酸排列顺序为：Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys,如测一个九肽,测得N端氨基酸残基为Thr,又分别测得片段:Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Val-Lys-Ala-Ala-TrpThr-Asn-Val-Lys,另外，亦可以通过基因中核苷酸顺序推测蛋白质的氨基酸顺序,四、蛋白质空间结构的测定,1.X射线晶体衍射法,X-衍射图代表射线穿过（蛋白质）晶体的一系列平行剖面的各原子的电子密度，然后再借助计算机绘制出三维的电子密度图,2.二维磁共振技术,3.蛋白质空间结构的预测,（1）根据分子力学、分子动力学、物理化学原理，从理论上计算推测蛋白质的空间结构,（2）从已知蛋白空间结构规律，从一级结构推测空间结构,Part 1 练习组成蛋白质的基本单位是什么？什么是等电点？,Part 2 练习 分子筛层析时，先流出的是较大的蛋白还是较小的蛋白？,