犬小孢子菌PPT.ppt
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1、犬小孢子菌SSH文库中差异基因的研究,硕士研究生:张渊指 导 教 师:杨国玲 教授专 业 名 称:皮肤病与性病,前 言,犬小孢子菌主要侵犯儿童引起白癣、脓癣和体癣儿童头癣48%,儿童体癣36%成人头体癣16%,研究背景,1.儿童皮脂腺发育不完全 2.犬小孢子菌蛋白酶的作用,犬小孢子菌儿童头癣发病机制,推测儿童头皮是否诱导犬小孢子菌毒力因子,?,材 料,前期试验克隆:菌液PCR,菌液克隆 主要试剂:1.DIG High Prime Labeling&Detection Starter Kit I 2.杂交膜 3.Real time PCR Kit 主要仪器:1.CL1000紫外交联仪(UVP)2
2、.Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System,儿童头皮培养菌株(tester),儿童光滑皮肤培养菌株(driver1),成人头皮组织培养菌株(driver2),斑点杂交实时PCR,技术路线,获得差异基因,前期完成试验,消减文库,SSH,方法-斑点杂交,正反向消减文库PCR扩增,制备探针,酶切回收,杂交膜,DIG-High Primer,探针,菌液PCR产物,阳性克隆测序,阳性克隆菌液送大连宝生物测序:菌种为DH10B,载体为PMD-T18 测序使用引物为:F Primer(M13-47);R Primer(RV-M),测序分析,序列预处理,去除混杂
3、基因,同源性比对,功能分类,实时PCR,TestermRNA,Driver1mRNA,Driver2mRNA,2个基因,2个基因,18S rRNA,3个RNA池均为构建消减文库时保存的总RNA,探针引物序列,结 果消减文库酶切前后结果,结 果-斑点杂交,消减文库1斑点杂交部分结果,正向 反向,正向,反向,消减文库2斑点杂交部分结果,结 果-斑点杂交,阳性克隆测序及分析,共得到106个有效序列,共得到13个ESTs,8个ESTs找到了同源基因,6个同源基因具有功能分类,消减文库1差异基因比对结果,消减文库2差异基因比对结果,蛋白功能分类,实时PCR-18s rRNA,18s rRNA基因在3个R
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