《疫酶组织化学技术》PPT课件.ppt

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1、免疫酶组织化学技术,第一节 基 本 原 理,抗原抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。,免疫酶组化,免疫学(抗原抗体反应),酶细胞化学(底物显色反应),+,特异性 敏感性 定位性 可视性,PAP法,免疫酶组织化学基本组成：抗原 抗体 放大系统 显色系统,ABC法,免疫酶特点：信号定位准确 标本可长期保存 阳性标记与病变关系 方法简便，易推广,一、酶及其特点 酶选择标准：该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。,第二节 酶 和 底 物,酶易于纯化，获得纯制品。酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。酶在

2、PH中性液内较稳定。组织中不应存在与底物作用的内源性酶。,符合上述条件：辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶,（一）辣根过氧化物酶（HRP）分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 稳定，易获得较高纯度酶 具有较高活性及特异性 可溶性佳，生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少 可作用于多种底物，产生不同颜色 HRP穿透力强，易进入细胞内,（二）碱性磷酸酶（AKP）从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱 内源性AKP较高 左旋咪唑具有抑制作用,（三）葡萄糖氧化酶（GOD）底物为葡萄糖，终产物稳定 体内无内源性GOD 分子量大，穿透力较弱,二、底物及其特点 酶底物酶底物酶产物（显色）

3、,HRP的底物：HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。,HRP显色反应：HRPH2O2 HRPH2O电子供体（氧化型）,电子供体,电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。,HRP常用的电子供体：3.3-二氨基联苯胺(DAB)棕色 氨乙基卡巴唑(AEC)红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。4-氯-1-茶酚（4CN）蓝色，易弥散，不能久保存 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB)黄色,AKP底物：AKP常用的底物为-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB蓝色 固红TR红色,第三节 酶标记抗体法 酶标记抗体法（Enzayme

4、 Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。,一、直接法原理：HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原-抗体 HRP复合物,直接法,步骤：一步完成特点：方法简便、省时，专一 性强，非特异染色轻，但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。,二、间接法原理：HRP标记在第二抗体上，抗原-特异性抗体-第 二抗体 HRP复合物步骤：二步法,组织抗原,第一抗原,第二抗体,过氧化物酶,间接法,特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。但较直接法费时，非特 异染色稍重。,第四节 酶 抗

5、 酶 法 制备抗酶抗体 制备PAP复合物,酶桥法,组织抗原,第一抗体,第二抗体,第三抗体（抗酶抗体）,HRP,一、PAP法原理：抗原-特异性抗体-第 二抗体（桥抗体）-PAP复合物步骤：三步法,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,PAP法,HRP,特点：敏感性较高，背景染色较轻 但特异性抗体与PAP必须为 同一种属动物,二、双PAP法：原理：在PAP的基础上再重复 第二抗体和PAP复合物抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP-第二抗体-PAP复合物,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,双PAP法,HRP,双PAP法,步骤：五步法 特点：敏感性较高缺点：但步骤多，费时，非特

6、 异背景重,三、APAAP法原理：抗原-特异抗体-第二 抗体-APAAP复合物步骤：三步法,APAAP法,特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。但产物易溶于有机溶剂,第五节 卵白素-生物素Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成Biotin小分子维生素Avidin和Biotin具有较高亲和力,一、ABC法 Avidin Biotin Complex原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin,酶素化BiotinAvidin-ABC 复合物 抗原-特异抗体-Biotin标记 第二抗-Avidin Biotin HRP,组织抗原,第一抗体,第二抗体,HRP,生物素,卵白素,ABC

7、法,步骤：三步法特点：敏感性较高，特异性强，应用范围广,某些脏器存在内源性生物素 干扰 Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应,SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase Complex SABC法已代替ABC法,二、LSAB法 Labelled Streptavidin Biotin Method原理：Biotin标记第二抗体,LSAB法,HRP标记Avidin 抗原-特异性抗体-Biotin标记第二抗体-Avidin HRP复合物,步骤：三步法特点：敏感性高，特异性强，方法简便,第六节 多聚合物酶法 HRP-多聚合物-抗体 一、Epos法 Enhanc

8、ed polymer one-step staining,多聚合物酶法,组织抗原,一抗,HRP,多聚骨架,EPOS 方法,原理：采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异 性抗体和HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成 HRP-多聚合物-特异性 抗体。,步骤：一步法特点：快速，简便，特异性强，敏感性高 但商品化种类不全，价格昂贵,二、EnVision法 Enhanced Labelled Polymer System原理：HRP-多聚合物-第二 抗体,组织抗原,一抗,二抗,酶,多聚骨架,第一步,第二步,EnVisionTM方法,特点：敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和10 mole第二抗体）特异性强：复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。,第七节 基本操作步骤,1.抗原修复2.内源性过氧化物抑制3.正常血清封闭4.第一抗体,5.第二抗体6.酶标记体7.DAB-H2O2显色,第八节 抗原定位及非特异染色,组织细胞 固定问题 脱蜡不彻底 内源性过氧化物 内源性生物素,抗原 抗原弥散 抗原异常表达 共同抗原决定簇,特异性抗体 非特异吸附 抗体不纯 交叉反应,第二抗体 IgG交叉反应 二抗不纯,标记物 质量 纯度 标记水平,底物溶液 DAB H2O2,操作 复染 抗体稀释度 孵育时间 PAS洗涤,第九节 免疫酶方法评价,