《外源基因表达》PPT课件.ppt
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1、第七章 外源基因表达,一、表达机制1起始转录:转录起始的速率是gene表达的限速步骤,用诱导型启动子(Lac、Trp、PL/PR、tac、组成型启动子:T7)2MRNA延伸与稳定:正常终止序列、减少DNA反向转录产生反义mRNA、polyA掺入对3正确加工3MRNA有效翻译:AUG首选起始codon、SD序列与16srRNA互补结合,含有至少AGGAGG中4个碱基、SD与ATG间距离3-9bp、翻译起始区周围不形成明显二级结构、codon选择性相近(没有明显偏好性不同)4Pr稳定性:构建融合pr、分泌pr、包涵体pr、pr水解酶缺陷型受体细胞,第七章 基因表达系统,外源基因表达系统泛指目的基因
2、与表达载体重组后,导入合适受体细胞,并在其中有效表达,产生目的基因产物1E.coli表达系统:常用lac&tac:以lac操纵子调控机制为基础:lacP lacO 结构基因(lacZ,Y,A),lacI 阻遏pr,IPTG诱导,PL&PR:以phage溶原/溶菌循环T7启动子:T7RNA聚合酶识别序列在pET中MCS上端,RNA聚合酶位于BL21(DE3)基因组中,上端为lac启动子调控,IPTG,第七章 基因表达系统,外源pr表达形式:包涵体pr:融合pr:寡聚型pr:多表达单元重组、多顺反子、多编码序列,第七章高效表达策略,优化表达载体设计:启动子和mRNA中SD序列优化,强启动子,SDA
3、TG间距,RBS茎环结构稀有codon tRNA,外源mRNA稳定性、外源pr稳定性:pr分泌胞外,pr E缺失,pr E敏感序列修饰,pr稳定性因子优化发酵过程:工艺 生物学:菌体生长,表达条件,产物总量,The expression vector,Most important elements in the vectorPromoter-35:TTGACA(E.coli)-10:TATAAT(E.coli)Terminator(hairpin)Ribosome binding site(RBS)Selection markerVector replication sequence(ori)
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