《高效液相色谱分析》PPT课件.ppt
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1、复习,2023/8/3,分离度R定义;为什么可用分离度R作为色谱柱的总分离效能指标?能否根据理论塔板数来判断分离的可能性?为什么?根据“相似相容”原理,色谱的流出规律?热导检测器适用范围与工作原理?,色谱流出规律,分离非极性物质,一般选用非极性固定液,各组分按沸点次序先后流出色谱柱,沸点低的先出峰,沸点高的后出峰。分离极性物质,选用极性固定液,各组分按极性顺序分离,极性小的先流出色谱柱,极性大的后流出色谱柱。分离非极性和极性混合物时,一般选用极性固定液,这时非极性组分先出峰。对于形成氢键的试样,如醇、酚、胺和水等,一般选用极性或氢键型固定液,各组分按与固定液分子间形成氢键能力大小先后出峰。,2
2、023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,第三章高效液相色谱分析法,一、高效液相色谱法特点Characteristic of HPLC二、影响色谱峰扩展及分离的因素The factors that influence peak expansion and sepration,high performance liquid chromatograph,3-1概述,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,经典LC与HPLC比较,2023/8/3,HPLC:采用高压输液泵,高效微粒固定相和高灵敏度检测器,HPLC特点:高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便
3、,2023/8/3,GC与HPLC的比较,2023/8/3,与GC比较,HPLC的优点,分析对象广 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物;HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制,适用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。原则上讲,几乎可以分析除永久气体外所有的有机和无机化合物。流动相对分离起作用 气相色谱的流动相仅起运载作用,对组分不产生相互作用力;HPLC的流动相对组分产生相互作用力,相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行,2023/8/3,缺点:仪器设备费用昂贵,操作严格。,与GC相比,流动相差别,GC:流动相为惰性气体组分与流
4、动相无亲合作用力,只与固定相作用 HPLC:流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力,为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素,对分离起很大作用流动相种类较多,选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,2023/8/3,2023/8/3,影响色谱峰扩展及分离的因素,基本概念及基础理论同气相色谱:保留值、分配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离因子)、塔板理论及速率理论。由于流动相的差别,对色谱过程必然产生影响。,2023/8/3,速率理论(与GC对比),GC:HPLC:,2023/8/3,速率理论(与GC对比),讨论:
5、1)流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next2)涡流扩散项及其影响 next,2023/8/3,速率理论(与GC对比),2023/8/3,速率理论(与GC对比),3)传质阻抗项及其影响,2023/8/3,HPLC法中分离条件的选择,1.固定相与装柱方法的选择:选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp10m)首选化学键合相,匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择:选粘度小、低流速的流动相甲醇,1ml/min 3.柱温的选择:选室温250C左右,2023/8/3,2023/8/3,第三章高效液相色谱分析法,一、液-液分配色谱liquid-liquid partition chromatogr
6、aph二、液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatograph三、离子交换色谱ion-exchange chromatograph五、离子对色谱ion-pair chromatograph四、离子色谱ion chromatograph六、排阻色谱size-exclusion chromatograph,3-2主要分离类型与原理,high performance liquid chromatograph,basic principle and main separating types,2023/8/3,一、液-液分配色谱liquid-liquid parti
7、tion chromatography,固定相与流动相均为液体(互不相溶);基本原理:组分在固定相和流动相上的分配;流动相:对于亲水性固定液,采用疏水性流动相,即流动相的极性小于固定液的极性(正相 normal phase),反之,流动相的极性大于固定液的极性(反相 reverse phase)。正相与反相的出峰顺序相反;固定相:早期涂渍固定液,固定液流失,较少采用;化学键合固定相:(将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶(担体)表面的游离羟基上。C-18柱(反相柱)。,2023/8/3,二、液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography,固定相:固体
8、吸附剂为,如硅胶、氧化铝等,较常使用的是510m的硅胶吸附剂;流动相:各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理:组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸;适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样,对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性;缺点:非线形等温吸附常引起峰的拖尾;,2023/8/3,三、离子交换色谱ion-exchange chromatography,固定相:阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂;流动相:阴离子离子交换树脂作固定相,采用酸性水溶液;阳离子离子交换树脂作固定相,采用碱性水溶液;基本原理:组分在固定相上发生的反复离子交换反应;组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在
9、形式等有关。亲和力大,保留时间长;阳离子交换:RSO3-Na+M+=RSO3-M+Na+阴离子交换:RNR4+Cl-+X-=RNR4+X-+Cl-应用:离子及可离解的化合物,氨基酸、核酸等。,2023/8/3,四、离子对色谱ion pair chromatography,原理:将一种(或多种)与溶质离子电荷相反的离子(对离子或反离子)加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物,使其能够在两相之间进行分配;阴离子分离:常采用烷基铵类,如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子;阳离子分离:常采用烷基磺酸类,如己烷磺酸钠作为对离子;反相离子对色谱:非极性的疏水固定相(C-18柱),
10、含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相,试样离子X-进入流动相后,生成疏水性离子对Y+X-后;在两相间分配。,2023/8/3,五、离子色谱ion chromatography,离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一项技术,其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料,并采用淋洗液抑制技术和电导检测器,是测定混合阴离子的有效方法。,传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题:(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长;(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。,2023/8/3,1、离子色谱法原理,离子交换原理,与传统离子交换的不同点:采用交换
11、容量非常低的特制离子交换树脂为固定相;细颗粒柱填料,高柱效;采用高压输液泵;,低浓度淋洗液或本底电导抑制(在分离柱后,采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导);可采用电导检测器,快速分离分析微量无机离子混合物;各种抑制装置及无抑制方法的出现,发展迅速。,2023/8/3,2、离子色谱优点,(1)分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析;,(2)分离能力高 在适宜的条件下,可使常见的各种阴离子混合物分离;例:使用双柱法,在十几分钟内,可使七种阴离子完全分离。,(3)分离混合阴离子的最有效方法(4)耐腐蚀,仪器流路采用全塑件,玻璃柱,2023/8/3,3、离子色谱装置类型 suppressed ap
12、paratus of IC,抑制型:抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.010.05毫摩尔/克干树脂。,非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液,如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连,不需抑制柱。,2023/8/3,离子色谱连续抑制装置图,2023/8/3,离子色谱连续抑制原理图,2023/8/3,4、离子色谱的应用 application of IC,阴离子分析:双柱;薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流动相:0.003molL-1 NaHCO3/0.002
13、4 molL-1 Na2CO3,流量138 mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离,各组分含量在350 ppm。,2023/8/3,六、排阻色谱色谱size-exclusion chromatography,固定相:凝胶(具有一定大小孔隙分布);,原理:按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙,由其中通过,出峰最慢;中等分子只能通过部分凝胶空隙,中速通过;而大分子被排斥在外,出峰最快;溶剂分子小,故在最后出峰。全部在死体积前出峰;可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,2023/8/3,第三章高效液相色谱分析法,一、液相色谱固定相stationary phase
14、 of HPLC二、液相色谱流动相 mobile phase of HPLC三、分离条件的选择,3-3 3-4 液相色谱的固定相液相色谱的流动相,high performance liquid chromatograph,stationary phase and mobile phase of HPLC,2023/8/3,一、液相色谱固定相 stationary phases of LC,1.液-液分配及离子对色谱法固定相(1)全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体;早期采用100m的大颗粒,表面涂渍固定液,性能不佳已不多见;现采用10m以下的小颗粒,化学键合制备柱填料;,(2
15、)表面多孔型担体(薄壳型微珠担体)3040m的玻璃微球,表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小,柱容量底;,2023/8/3,(3)化学键合固定相,化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相;a.硅氧碳键型:SiOC b.硅氧硅碳键型:SiOSi C 稳定,耐水、耐光、耐有机溶剂,应用最广;c.硅碳键型:SiC d.硅氮键型:SiN,2023/8/3,化学键合固定相的特点,(1)传质快,表面无深凹陷,比一般液体固定相传质快;(2)寿命长,化学键合,无固定液流失,耐流动相冲击;耐水、耐光、耐有机溶剂,稳定;(4)选择性好,可键合不同官能团,提高选择性;(5)有利于梯度洗脱;,存在着双
16、重分离机制:(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率:分配为主;低覆盖率:吸附为主;,2023/8/3,2.液-固吸附分离固定相,种类:硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等;结构类型:全多孔型和薄壳型;粒度:510 m;,2023/8/3,3.离子交换色谱分离固定相,结构类别:(1)薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体,表面涂约1%的离子交换树脂;(2)离子交换键合固定相 薄壳键合型;微粒硅胶键合型(键合离子交换基团)树脂类别:(1)阳离子交换树脂(强酸性、弱酸性)(2)阴离子交换树脂(强碱性、弱碱性),2023/8/3,4.空间排阻分离固定相,(1)软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构;
17、水为流动相。适用于常压排阻分离。(2)半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物,有机凝胶;非极性有机溶剂为流动相,不能用丙酮、乙醇等极性溶剂(3)硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等;化学稳定性、热稳定性好、机械强度大,流动相性质影响小,可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球,具有恒定孔径和窄粒度分布。,2023/8/3,二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC,1.流动相特性(1)液相色谱的流动相又称为:淋洗液,洗脱剂。流动相组成改变,极性改变,可显著改变组分分离状况;(2)亲水性固定液常采用疏水性流动相,即流动相的极性小于固定相的极性,称为正相液液色谱法,极性柱也称正相柱。(3
18、)若流动相的极性大于固定液的极性,则称为反相液液色谱,非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2023/8/3,2.流动相类别,按流动相组成分:单组分和多组分;按极性分:极性、弱极性、非极性;按使用方式分:固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性,以改进分离或调整出峰时间。,2023/8/3,3.流动相选择,在选择溶剂时,溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时:首先选择中等极性溶剂,若组分的保留时间太短,降低溶剂极性,反之增加。也可在低极性溶剂中,逐
19、渐增加其中的极性溶剂,使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序:水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),2023/8/3,4.选择流动相时应注意的几个问题,(1)尽量使用高纯度试剂作流动相,防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,(2)避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失;酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,(3)试样在流动相中应有适宜的溶解度,防止产生沉淀并在柱中沉积。,(4)流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时,流动相
20、不应有紫外吸收。,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,第三章高效液相色谱分析法,一、高效液相色谱仪HPLC二、流程及主要部件general process and main assembly of HPLC,3-5高效液相色谱的特点与仪器,high performance liquid chromatograph,feature and instrument of HPLC,2023/8/3,一、液相色谱仪器 hig
21、h performance liquid chromatograph,2023/8/3,液相色谱仪(2),2023/8/3,液相色谱仪(3),2023/8/3,液相色谱仪(4),2023/8/3,二、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC,1.流程,2023/8/3,2.主要部件,(1)高压输液泵主要部件之一,压力:150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(10m),液体的流动相高速通过时,将产生很高的压力,因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,2023/8/3,2023/8
22、/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,(2)梯度淋洗装置,外梯度:利用两台高压输液泵,将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室,混合后进入色谱柱。,内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,2023/8/3,(3)进样装置,流路中为高压力工作状态,通常使用耐高压的六通阀进样装置,其结构如图所示:,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,(4)高效分离柱,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,202
23、3/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,2023/8/3,平均颗粒度,颗粒度分布颗粒度(dp)颗粒度越小:柱效越高(传质好,涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)颗粒分布颗粒分布越宽柱效低(渗透性差)颗粒形状球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀无定型:柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展,对HPLC柱的了解(一),平均孔径/孔体积孔径/孔体积分布大的孔径可分析高分子量的分子键合相化学影响化合物的分离度:a 不同键合相对不同种类的化合物分离不同可能导致色谱的分离机理不同如:C18、C8、CN,对HPLC柱的了解(二),含碳量含碳量越高,k值越大(固定相传质效应增加)高
24、含碳量有利于不易保留的化合物的分离水解稳定性好,重现性好有利于极性化合物的拖尾改善低含碳量有利于分析中性及碱性化合物降低溶剂损耗,不同色谱柱的含碳量,色谱柱C%k苊(50/50的乙腈/水)Symmetry C181917Zorbax ODS1715.7LiChrosorb RP-181510.3Symmetry C81212.5Resolve C-181212.4Ultrasphere ODS1111.3Partisil ODS-31112.0mBondpak C-1810 7.9Nova-Pak C-18 7 5.5,对HPLC柱的了解(三),填料的端基封口封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾
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