《重组子筛选》PPT课件.ppt

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1、重组子的筛选,生物与食品工程学院,重组子的筛选,并非所有的受体细胞都能导入重组子DNA分子,导入外源DNA分子的受体细胞不一定能良好增殖。为了从众多的受体细胞中筛选出含有外源重组DNA的克隆子，必需利用载体、宿主细胞的特性对受体细胞进行筛选或选择。,重组子的筛选,导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。含有重组DNA分子的转化子称为重组子。如果重组子中含有目的基因，称为阳性克隆子，或期望重组子。,重组子的筛选,重组子的筛选,将转化处理后的受体细胞接种在选择培养基上，培养一定时间，根据菌落生长情况挑选转化子。在普通培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物由载体DNA分子上

2、携带的选择标记基因所决定，如：抗生素、显色剂。,重组子的筛选,筛选方法主要包括：1.抗药性筛选2.显色筛选3.依据重组子结构特征筛选,抗药性筛选,利用载体上的抗药性选择标记进行筛选。氨苄青霉素（Ap或Amp），bla基因可以编码丙酰胺酶，可降解Ap氯霉素（Cm或Cmp），cat基因编码氯霉素乙酰转酰基酶，使Cm乙酰化而失效卡那霉素（Km或Kan），Km抗性基因可以转译一种能修饰Km的酶，阻断Km对核糖体的干扰。,抗药性筛选,四环素(Tc或Tet)，Tc抗性基因转译一种能改变细菌膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。链霉素(Sm或Str)，Sm抗性基因转译一种能修饰Sm的酶，抑制Sm

3、与核糖体结合。,抗药性筛选,抗药性筛选主要用于重组质粒DNA转化子的筛选。正向选择插入失活则成为负向选择培养时间不宜过长，1216h，转化子菌落会降解药物，导致周围药物浓度降低，长出假转化子菌落。,抗药性筛选,插入失活外源目的基因插入载体后，抑制筛选标记基因的表达。插入表达外源目的基因插入载体后，激活筛选标记基因的表达。在筛选标记基因前连上一段负调控序列。,显色筛选,原理：如果在载体DNA上组入LacZ，则重组DNA分子会在含有X-gal和IPTG的培养基中得到蓝色的转化子菌落。由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长的时间，因此观察和确定转化子菌落的培养时间可适当延长。,营养缺陷型筛选,

4、一些参与核苷酸代谢的基因酵母载体选择标记基因培养基,依据重组子结构特征进行筛选,凝胶电泳分析：在转化子筛选的基础上，依据有外源DNA片段的重组质粒与载体DNA之间的大小差别来区分重组子和非重组子。1.在平板上挑选菌落2.将菌落放入细菌裂解液，悬浮离心取上清3.电泳优点：直观、快捷、尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。缺点：载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接,依据重组子结构特征进行筛选,限制性核酸内切酶酶切分析：从转化菌落中挑选菌落，提取质粒，用限制性核酸内切酶进行酶切，然后通过凝胶电泳分析。优点：可以判断DNA分子插入的方向及分子量的大小。,利用PCR方法筛选重组子,外源DNA两侧序列

5、多数是已知的通过两侧序列设计引物，扩增电泳,噬菌斑筛选,对于DNA系统而言，转导受体菌后，转化子被裂解成噬菌斑，而非转化子则能正常生长，两者很容易区分。1.重组DNA必须在野生型DNA长度的78105%范围内才能成功包装。2.空载DNA也能正确包装，可以通过筛选标记基因进行筛选。,筛选植物转化细胞,在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因经常称为“报告基因”，在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达筛选转化细胞。,筛选植物转化细胞,荧光素酶基因（LUC）:LUC是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化生物发光反应。荧光素酶可以在植物细胞内正常表达优点：检测迅速、灵敏度高、无

6、污染，是一种理想的报告基因。,筛选植物转化细胞,抗除草剂基因(bar)：bar基因编码的酶能够解除非选择性除草剂的毒性除草剂是一种谷氨酸类似物，强烈抑制谷胺酰胺合成酶，从而导致植物体内氨的积累，并使植物死亡bar基因可以将除草剂乙酰化，从而使植物具有除草剂的抗性。,筛选植物转化细胞,葡萄糖酸苷酶（GUS），GUS可以催化人工合成的底物4甲基伞形花酮，产生一种荧光物质，可用荧光光度计定量测定。简便快捷、灵敏度高，已被广泛应用与植物基因转化实验，尤其是进行外源基因瞬间表达的系统。,筛选植物转化细胞,氯霉素乙酰转移酶（CAT），可以催化氯霉素失活，因此，与外源DNA共转化的Cat基因能使转基因植物具有抗氯霉素的活性。,哺乳动物转基因细胞的筛选,胸苷激酶基因(TK)二氢叶酸还原酶基因（DHFR）黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（XGPRT）这些基因参与核苷酸代谢，缺失后导致营养缺陷。,Thank You,