《酶活性的测定》PPT课件.ppt
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1、过氧化物酶()活性的测定愈创木酚法,一、实验原理过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应,产物为醌类化合物。实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物。在此酶存在下,H2O2 将愈创木酚氧化生成茶褐色产物。此产物在470nm 有最大光吸收,故可通过470nm处的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。,二、材料和设备,、材料:马铃薯块茎、仪器设备:751 型分光光度计、离心机、研钵、25ml 容量瓶、量筒、试管、吸量管。、试剂:0.05ml/L愈创木酚溶液,0.05ml/L的磷酸缓冲液(pH5.5),2%H2O2,0.1mol/L儿茶酚溶液,20%三氯乙酸溶液,三、实验步骤,、酶液的制备取5.0g洗净去皮的马铃薯块
2、茎,切碎,放入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中,于3000g水中离心10min,上清液转入25ml 容量瓶中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,低温下保存备用。,、过氧化物酶活性的测定 酶活性测定的反应体系包括:2.9ml 0.05mol/L磷酸缓冲液、1.0ml 2%H2O2、1.0ml 0.05mol/L 愈创木酚和0.1ml酶液。以在沸水中加热5min的酶液为对照,做二组重复实验。反应体系加入酶液后,立即于37水浴中保温15min,然后迅速转入冰浴中,并加入2.0ml 20%三氯乙酸终止反应。然后,过滤(或5000g 离心10m
3、in),滤液适当稀释,用751型分光光度计在470nm波长下测定反应体系的吸光度。,四、实验结果,以每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活力单位 酶活力=D 酶的比活力=D 式中,A为反应时间内吸光度的变化;W为马铃薯鲜重(g);t为反应时间(min);D为稀释倍数,即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数,A,0.01t,A,0.01Wt,CAT过氧化氢酶活性测定方法,过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名触酶(Catalase,CAT),是一类以铁卟琳为辅基的结合酶,由4个亚基组成,分子量为240 000。存在于动植物组织与细胞中的氧化还原酶类,它专一性地将细胞代谢
4、产生的过氧化氢分解成H2O和02,避免了H202在体内积累,从而可维持体内正常的活性氧水平。是最早发现的与种子活力有关的氧化酶类之一.,过氧化氢酶的应用:,被用于食品包装,防止食物被氧化。在纺织工业中,被用于除去纺织物上的过氧化氢,以保证成品是不含过氧化物的。它还被用在隐形眼镜的清洁上:眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡后,使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。近年来,过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢,目的是增加表皮上层的细胞氧量。植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸(利用氧气并生成二氧化碳)和共生性氮固定(将氮气(N2)解离为活性氮原子)。细胞被病原体感染时,
5、过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。其活性也与粮食品质之间有一定的相关性,是一项衡量谷物品质的重要指标。,过氧化氢酶的测定:,化学测定法:高锰酸钾滴定法,碘量法。光度法:紫外分光光度法,荧光分析法,化学发光法。电化学法:极谱氧电极法,电流测定法,电泳一染色法。放射化学测定法。简易气量测定法。,高锰酸钾滴定法:,过氧化氢酶(CAT)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。据此,可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸钾溶液(
6、在酸性条件下)滴定多余的H2O2。即可求出消耗的H2O2的量。,酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示:酶活(mgH2O2/gFWmin)=式中 A对照KMnO4滴定毫升数;B酶反应后KMnO4滴定毫升数;VT酶液总量(ml);V1反应所用酶液量(ml);W样品鲜重(g);1.71ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。,紫外分光光度法:H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。过氧
7、化氢酶活性(u/gFW/min)=式中 A240=AS0 AS0加入煮死酶液的对照管吸光值;AS1,AS2样品管吸光值;Vt粗酶提取液总体积(ml);V1测定用粗酶液体积(ml);FW样品鲜重(g);0.1A240每下降0.1为1个酶活单位(u);t加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。,方法比较:研究认为,化学滴定法重复性差、紧密度低、操作繁琐、检测线低,不适于大批量的样品测定。其优点是不需要任何特殊的仪器,适用性比较广泛。紫外分光光度法具有重现性好,操作简单、快速、检测线相对较低得到优点。但是对于测定底物或产物改变量方面不太准确。,总结:,综上所述,过氧化氢酶活性测定的方法大都基于过氧化
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