《酶工程制药》PPT课件.ppt
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1、第六章 酶工程制药,本章重点:产酶菌的要求;酶和细胞的固定化;本章难点:酶的人工模拟;酶的化学修饰;有机相的酶反应。,“绿色健康,“酶”力无限医药、洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食品(包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂)、饲料、皮革、造纸和化工等工业领域,第一节 概述,一、酶工程简介 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能,并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。,二、酶的来源目前工业生产酶制剂一般都以微生物为主要来源,原因:1.微生物种类多,酶的品种齐全2.微生物生长繁殖快,生产周
2、期短,产量高3.培养方法简单,原料来源丰富,价格低廉,经济效益高,可通过控制控制培养基来提高酶的产量。4.微生物具有较强的适应性和应变能力。可通过各种遗传变异的手段,培育出新的高产菌株。故目前工业上应用的酶大多采用微生物发酵法来生产。,三、酶的生产菌种1.对菌种的要求一个优良的菌种应具备以下几点要求:(1)繁殖快、产酶量高、酶的性质应符合使用要求,最好是产胞外酶的菌;(2)不是病原菌,也不产生有毒物质;(3)产酶性能稳定,不易变异退化,不易感染噬菌体;(4)能利用廉价的原料,发酵周期短,易于培养。,2.生产菌的来源(了解)生产菌种可从有关保藏机构获得,但大部分是从自然界中分离筛选得来的。筛选的
3、主要步骤:菌样采集 菌种的分离初筛 纯化 复筛 生产性能鉴定通过遗传学原理改良菌种的基本途径有:基因突变、基因转移和基因克隆。,3.目前常用的产酶微生物 工业上应用最广泛的产酶菌有:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。,四、酶在医药领域的应用(了解)1.在疾病诊断方面的应用包括两个方面:根据体内酶活力的变化来诊断疾病;用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病。2.在疾病治疗方面:酶作为药物作用于人体具有种类多、用量少、纯度高的特点。3.在药物生产方面的应用:利用酶的催化作用将前体物质转化为药物。4.在分析检测方面的应用:是以酶的专一性为基础、以酶作用后物质的变化为依据来进行的。,第二节 酶的固定化一、什么是固定
4、化酶?,水溶性酶,水不溶性载体,固定化技术,水不溶性酶(固定化酶),固定化酶:是被固定在某一有限空间内不再能自 由流动而仍有催化活性的酶。优点:不溶于水,易于与产物分离;可反复使用,反应易于控制;可连续化生产;稳定性好。,缺点:固定化过程中往往会引起酶的失活。增加了生产的成本 只能用于水溶性底物,而且较适用于小分子底物 胞内酶必须经过酶的分离纯化过程 不适宜用于多酶反应,酶和细胞固定化方法 酶和细胞固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法 网格型 微囊型物理吸附法 离子结合法 共价结合法 热处理(细胞),酶和细胞固定化模式,(1)载体结合法酶被吸附于惰性的固相载体或离子交换剂。根据酶分子与载体吸
5、附的性质有物理吸附、离子吸附和共价结合三种。,物理吸附法 使用对酶蛋白有高度吸附能力的硅胶、活性炭,氧化铝、高岭土、石英沙、火棉胶、多孔玻璃等在一定条件下与水溶酶作用制得。这些具有吸附能力的物质就叫做载体。,优点:操作简单,反应条件温和,酶活力损失少,载体可反复使用。缺点:易引起蛋白质表面变性,且由于结合力 弱,当反应液的pH值、离子强度、温度、底物浓度等发生变化时,会导致酶易从载体上部分或全部脱落。,离子结合法利用含有离子交换基团的固相载体(如具有交换基团的葡聚糖凝胶或纤维素)与酶蛋白分子的带电基团互相吸引(靠离子链)而形成络合物。,优点:制作简单,处理条件缓和,酶蛋白的活性中心和高级结构破
6、坏较少,可以制得活力较高的固定化酶。缺点:离子键结合较松散,如在高离子强度下进行反应时,酶与载体易分开。,第一个离子结合法固定化酶:DEAE Cellulose固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶:DEAE-Sephadex A-50固定化氨基酰化酶,共价结合法 酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。一般在温和条件下能参与偶联的蛋白质基团包括:游离羧基(包括肽链C-末端的-羧基等)、游离氨基(如肽链N-末端的-氨基)等。,优点:此法制得的固定化酶,酶分子和载体间的共价键较牢固,在介质组成发生改变和进行反应时,都不会造成酶的脱落,因而可以反复使用。缺点:制取固定酶较复杂,反应条件
7、比较剧烈,所以要制得酶活力很高的固定化酶较为困难。制作方法:有重氮化法、烷基化和芳基化法、肽法和戊二醛法等。,(2)交联法依靠双功能基团的试剂,使酶蛋白分子之间发生交联,凝集成网状结构而成为固定化酶,最常用的双功能试剂有戊二醛、顺丁稀二酸酐和乙烯共聚物等。那么酶蛋白中的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交连反应。,双功能试剂:常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H,使用戊二醛的酶固定化的交联方式:,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合酶分子;(a)酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶;(b)酶分子被结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定
8、化酶,(3)包埋法 将酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜的微型胶束内,但底物仍能渗入到里面与酶接触。微胶囊包埋法将酶包埋在半透性聚合体膜内,形成的直径为1100um。例如,天门冬酰胺酶(asparaginase)就是用这种方法作成微胶囊。,胶格包埋法,首先被采用的胶格包埋法是:固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙稀酰胺,丙稀酰胺引发剂inactiation,优点:利用此法制得的固定化酶,由于酶分子仅仅是被包埋起来,而未受到化学作用。酶蛋白几乎不起变化,可适用与多种不溶酶的制备。缺点:酶被包埋在内部,对大分子底物很难发生催化作用。所以用包埋法制备的酶,一般只适用与小
9、分子底物。,二、固定化细胞1.定义:将细胞限制或定位于特定空间位置的方法。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。,2.固定化细胞的特点优点(1)无需进行酶的分离纯化(2)细胞保持酶的原始状态,固定化过程中酶可回收;(3)细胞内酶比固定化酶稳定性更高;(4)细胞内酶的辅因子可再生;(5)细胞本身含多酶体系,可催化一系列反应;(6)抗污染能力强。缺点(1)利用的仅是胞内酶;(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在扩散限制作用;(3)载体形成的孔隙影响高分子底物的通透性。,(1)直接固定法(无载体法)不使用载体,借助物理(如加热、冰冻)、化学方法(如柠檬酸、各种絮凝剂)将细胞直接固定。一般只用于单
10、酶或少数几种酶催化的反应。(2)载体结合法:将细胞悬液直接与水不溶性的载体相结合的方法。原理同吸附法。(3)包埋法:将细胞定位于凝胶网格内的技术。应用最多的方法。操作方法与包埋酶法相同。(4)交联法:用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。较少使用(所用试剂对细胞毒性较大),3.固定化方法,三、固定化方法与载体的选择依据(了解),1.固定化方法的选择应考虑以下几个因素:(1)固定化酶应用的安全性:应尽可能选择无毒性试剂参与固定化。(2)固定化酶在操作中的稳定性:应选择最佳的固定化方法,以制备稳定性高的固定化酶。才能长期反复使用。(3)固定化的成本:包括水、电、气、设备和劳务投资。2.载体的选择
11、最好选择工业化生产中已大量使用的廉价材料为载体。,四、固定化酶和固定化细胞的性状和性质1、形状(1)颗粒状固定化酶:包括酶珠、酶块酶片和酶粉。特点:制备方法简单,比表面积大,转化效率高,适用于各种类型的反应器。(2)纤维状固定化酶:特点:比表面大,转化效率高,但只适用于填充床反应器。(3)膜状固定化酶:特点:表面积大,渗透阻力小,可用于酶电极,破碎后也可用于填充式反应器。(4)管状固定化酶:特点:机械强度大,切短后可用于填充床式反应器,也可组装成列管式反应器。,2.固定化酶的性质,(1)酶的活性:通常低于天然酶(有例外)。如:氨基酰化酶,70,15分钟,酶失去活性。而固定化后,70,15分钟,
12、有80%活性。(2)酶的稳定性 酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。,可能的原因:固定化增加了酶活性构象的牢固程度,可防止酶分子伸展变形;抑制酶的自身降解。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。,(3)酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升,最适温度也上升(有例外)。(4)酶的最适pH 带负电荷载体:最适pH 向碱性偏移。带正电荷载体:最适pH 向酸性偏移。,(5)酶的动力学特征 Km是表示酶和底物的亲和力大小的客观指标 酶经固定化后,Km一般都增大。最大反应速度Vm与天然酶接近。,与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子,导致酶的专一性发生改变。
13、,(6)酶的作用专一性,与固定化酶相比,固定化细胞的情况比较复杂。(1)有活性升高的现象。(2)稳定性的增加。(3)最适温度和最适pH常保持不变。,3、固定化细胞的性质,(1)酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状,一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。有两种方法:分批测量和连续测量。,五、固定化酶(细胞)的评价指标,(2)偶联率及相对活力 偶联率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力100%活力回收=固定化酶总活力/加入酶的总活力100%相对活力=固定化酶总活力/(加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)100%,(3)半衰期 在连续测定条件下,固定化酶(细胞)的活
14、力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间,以t1/2表示。是衡量稳定性的一项重要指标。,思考题,一、名词解释1.固定化酶 2.固定化细胞二、单项选择1._只适合于固定作用于小分子底物和产物的酶。A.物理吸附 B.包埋法 C.交联法 D.离子结合法2._反应条件比较激烈,固定化酶的酶活回收率较低。A.物理吸附 B.包埋法 C.交联法 D.离子结合法3.固定化细胞应用最多的方法是_。A.物理吸附 B.包埋法 C.交联法 D.离子结合法4._固定化酶比表面积大,转化效率高,适用于各种类型的生物反应器。A.颗粒状 B.纤维状 C.膜状 D.管状5.酶被固定化后,活力大都_,稳定性_。A.上升,不变 B
15、.不变,上升 C.下降,下降 D.下降,上升6.带负电荷的载体使固定化酶的最适PH向_偏移。A.酸性 B.碱性 C.不变7.相比在均相介质中的酶,固定化酶的一大优点是酶在使用中可以_。A.活性更高 B.永久 C.耐高温 D.多次,三、多项选择选择1.通过遗传学原理对产酶菌进行改良,其基本途径有_。A.基因突变 B.基因克隆 C.基因转移 D.基因连接 E.基因剪切2.应用广泛的产酶菌有。A.金黄色葡萄球菌 B.链霉菌 C.枯草芽孢杆菌 D.大肠杆菌 E.啤酒酵母3.固定化酶或细胞,工业上应用的包埋载体主要为 _。A.卡拉胶 B.海藻胶 C.碳酸钙 D.硅胶 E.甲壳素,四、简答、论述1.为什么
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