《酶催化反应动力学》PPT课件.ppt

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1、第1章 酶催化反应动力学,基本要求：,了解酶反应的特点，掌握MM方程的推导、应用和各种抑制动力学的特征及其应用；熟悉复杂酶反应及其失活动力学的处理方法。,MM方程的推导、应用，各参数的意义及求取。,重点和难点：,第1章 酶催化反应动力学,1.1 酶催化反应概论,1.2 简单的酶催化反应动力学,1.3 有抑制的酶催化反应动力学,1.4 复杂的酶催化反应动力学,1.5 反应条件对酶催化反应速率的影响,1.6 酶的界面催化反应动力学,总结,1.1 酶催化反应概论,国际生物化学协会IUB（International Union Biochemistry）按生化反应类型分为6类：氧化还原，转移，水解，裂

2、合，异构，连接酶。,酶：生物体内活细胞为其自身代谢活动而产生的具有催化活性的一类蛋白质。,降低反应的活化能，加快生化反应的速率；但不改变反应的方向和平衡关系；不能改变反应的平衡常数，而只能加快反应达到平衡的速率。,酶的催化共性,反应前后状态不变：酶在反应过程中，其立体结构和离子价态可以发生某种变化，但在反应结束时，一般酶本身不消耗，并恢复到原来状态。,酶的催化特性,高效的催化活性,高度的专一性,酶反应需要辅因子的参与,酶的催化活性可被调控,酶易变性与失活,高效的催化活性,酶的分子活力：在最适宜的条件下，每1mol酶在单位时间内所能催化底物的最大量（mol）。,酶催化中心活力：在单位时间内，每一

3、个酶的催化中心所能催化底 物的量（mol）。又称为酶的转换数。,酶活力：在特定条件下，每1min能催化1umol底物转化为产物时所需要的酶量，称为一个酶单位，或称国际单位，用U表示。,比活力：指每1mg酶所具有的酶单位数，用U/mg表示。也可以根据实际情况自定义。,强的专一性,专一性（选择性）：一种酶仅能作用于一种物质或一类结构相似的物质进行某一种反应的特性,绝对专一性：脲酶,相对专一性：脂肪酶,反应专一性,底物专一性,立体专一性,官能团专一性，序列专一性,酶反应需要辅因子的参与,辅酶、辅基、辅底物,金属离子：金属酶（金属为辅基），与酶为可逆的结合,Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Zn2+，

4、Mn2+，Co2+，Fe3+，Mo6+等,酶易变性与失活,物理因素：热、压力、UV、X-ray、声波、振荡、冻结等,化学因素：酸、碱、丙酮、乙醇、尿素、表面活性剂、重金属盐、氧化剂等。,热变性：Topt,酸碱变性：（pH）opt,氧化变性：巯基酶（SH酶）易在空气中氧化SH S-S而失活,酶反应的特性,条件温和，能耗低 反应专一，精制易，体系较纯易于控制，产物浓度高 立体专一性利于不对称合成、制备自然界没有的新物质 用组合酶、底物完成指定的多步合成转换反应,优点,缺点,只能利用底物中部分组分，一般只能在水溶液中进行 温和的反应条件也易于微生物繁殖易使酶染杂菌。失活后难以再生、复性 只限一、二步

5、反应，酶昂贵，较脆弱易变性，失活,1.1.2 酶的催化反应机制,活性部位（活性中心）必需基团接触基团结合基团（结合中心）催化基团（催化中心）辅助基团,1.1.2.2 酶反应的专一性机制,锁钥学说诱导契合学说过渡态学说,1.1.2.3 酶反应的高效性机制,酸碱催化共价催化邻近及定向效应扭曲变形和构象变化效应多元催化与协同,酶催化动力学的研究历史,1897年，Buchner成功地用不含细胞的酵母液实现发酵，说明具有发酵作用的物质存在于细胞内，并不依赖活细胞。1902年，Henri提出酶与底物作用的中间复合物学说。1913年，Michaelis和Menten提出了酶催化反应动力学基本模型-米氏方程。

6、1925年，Briggs和Haldane对米氏方程做了修正，提出稳态学说。,1.2 简单的酶催化反应动力学,Michaelis 与 Menten 发展出酶动力学,Michaelis,Menten,Nelson&Cox(2000)Lehninger Principles of Biochemistry(3e)p.258,1.2.1 M-M方程的建立“活性中间复合物”学说,(1)反应机理,(2-1),快速“平衡”假设理论（L.Michaelis和M.L.Menten（1913）：,(b)CS CE,(a)CEo=CE+CES,(c)不考虑k-2,（Ks：解离常数）,(2-2),（2-4）,（2-5

7、）,由式（2-1）得M-M eq：,“拟稳态”假设（G.E.Briggs和J.B.S Haldane，1925）,Cs CE，中间复合物分解时所得到的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物浓度维持不变。,（2-6）,（2-7）,（2-8）,当k+2k-1时，Km=Ks。,如果有一个酶有几种底物，则对每一种底物，各有一个特定的Km值。并且，Km值还受pH及温度的影响。Km值作为常数只是对一定的底物，一定的pH值，一定的温度条件而言，测定Km可以作为鉴别酶的手段。,讨论：,k-1和k+2表示的是中间复合物ES解离的速率常数；k+1则表示的是生成中间复合物ES的速率常数。因此，当Km值大时，表

8、示复合物ES的结合力弱，易解离；当Km值小时，ES不易解离。,1.2.2 动力学特征,当rp1/2 rp,max时，KmCs。,Km：最重要的动力学常数，表达了反应性质，称为表观解离常数,（1）Cs Km,（2）Cs Km,（3）Cs 与 Km相当,1.2.3 M-M方程参数的确定,（1）Lineweaver-Burk法（简称L-B法）,(2)Eadie-Hofstee法(简称E-H法),（3）Hanes-Woolf法（简称H-W法），又称Langmuir作图法（L-B基础上乘以Cs）,(4)Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图 将M-M方程取倒数，两边均乘以rmax：

9、,应用直线作图法求取动力学参数 微分法,(a)L-B法；(b)H-W法；(C)E-H法,(5)积分法,微分法和积分法比较,微分法中要引入反应速率为变量，但实验中不能直接测定反应速率，在Cs与t的关系曲线上求取相应各点的切线的斜率，才能确定不同时间的反应速率；,积分法的主要问题是要保证随着反应的进行，反应产物的增加对反应速率不产生影响，否则不符合M-M方程成立的条件；,现在可用非线性最小二乘法来回归处理实验数据，直接求取动力学参数。,例1-1：有一均相酶催化反应，Km值为210-3 mol/L，当底物的 初始浓度Cs0为110-5mol/L时，若反应进行1min，则有2%的底物转化为产物。,试求

10、出:(1)当反应进行3min，底物转化 为产物的百分数是多少？此时底物和产物的浓度分别是多少？(2)当Cs0为110-6mol/L时，也反应了3min，底物和产物的浓 度又是多少？(3)最大反应速率rmax值为多少？,解：（1）Cs0110-5mol/L 0.01Km,t=1min时，Xs0.02,CsCso（1-Xs）110-5（1-0.02）0.9810-5mol/L,K=0.0202min-1,t=3min时，Cs0.9410-5mol/L，Xs6，Cp610-7mol/L,（2）同理得 t=3min时，Cs0.9410-6mol/L，Xs6，Cp610-8mol/L,（3）rmaxKK

11、m0.0202210-3 4.0410-5mol/（Lmin）,例1-2：室温下蔗糖在蔗糖酶的催化作用下水解得到产物蔗糖的初始浓度Cso1.0mmol/L，酶的初始浓度CEo0.01mmol/L，现有一间歇式操作的实验反应器测得了不同时间下蔗糖的浓度，根据实验提供的数据确定（1）该反应速率能否用M-M方程描述？（2）若可以，试求动力学参数Km和k+2的值。,例表2A 时间与蔗糖浓度的关系,1.3 有抑制的酶反应动力学,抑制剂（Inhibitor)：某些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能与酶分子上的某些必需基团（主要是指活性中心上的一些基团）发生化学反应，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应

12、速率降低，能引起这种抑制作用的物质称为抑制剂。,抑制作用：,不可逆抑制：如果抑制剂与酶的基团成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类抑制可使酶永久性地失活。例如：重金属离子对木瓜蛋白酶的抑制作用。,可逆抑制：可用诸如透析等物理方法把抑制剂去掉而恢复酶的活性，此时酶与抑制剂的结合存在着解离平衡的关系。,类型：竞争性抑制，非竞争性抑制，反竞争性抑制，混合型抑制。,1.3.1 竞争性抑制酶催化反应动力学,底物结构类似物，能在酶的活性部位上结合，从而阻止了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降。,特点：抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合之后，底物就不能再与酶结合，反之

13、亦然。,例：琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸为延胡索酸时，丙二酸是竞争性抑制剂,1.3.2 非竞争性抑制动力学,非竞争性抑制：抑制剂可以在酶的活性部位以外与酶相结合，并且这种结合与底物的结合没有竞争关系。如核苷对霉菌酸性磷酸酯酶的抑制。,酶可以同时与底物及抑制剂结合，两者没有竞争作用。酶与抑制剂结合后，可以与底物结合EI+SSEI;酶与底物结合后，也还可以与抑制剂结合。但是中间产物ESI不能进 一步分解为产物，因此酶活性降低。,这类抑制剂与酶活性中心以外的基团结合。其结构可能与底物毫无相关之处。大多数非竞争性抑制剂都是由一些可以与酶的活性中心之外的硫氢基可逆结合的试剂引起的。这种SH对于酶活性来说很重要

14、，可帮助维持酶分子的构象。,如何判断复合物SEI是否分解为产物？,可通过改变抑制剂的用量并测定底物的反应速率来判断,CI增至某一浓度，反应速率减小至趋于零：不能分解,随着CI的增加，反应速率趋于定值：能分解为产物,1.3.3 反竞争性抑制动力学,酶仅与底物结合后才能与抑制剂结合,如：肼对芳香基硫酸酯酶的抑制作用就属于此类。,各种抑制的比较,KISKSI：非竞争性抑制,KIS：反竞争性抑制,KSI：竞争性抑制,抑制百分数：,竞争性抑制：,非竞争性抑制：,反竞争性抑制：,1.3.5 底物抑制动力学,稳态法：,1.3.6 不可逆抑制动力学,类似非竞争抑制动力学，有机磷农药也是基于不可逆抑制作用,例1

15、-4：在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入不同浓度的底 物，并测定其初始反应速率，然后再在同样五个反应物系中分别加 入浓度为2.210-1mmol/L的抑制剂，并测其初始反应速率，其数 据见下表：（P24),试根据上述数据决定其抑制类型及动力学参数值。,【解】：以L-B作图法来判断抑制类型并求其参数（用Excel作图）,根据L-B图形可知为竞争性抑制,例1-5：某酶的Km值为4.710-5mol/L，如果rmax值2.2105mol/(Lmin)，在底物浓度为210-4mol/L和在(1)竞争性抑制剂与(2)非竞争性抑制 剂的浓度均为510-4mol/L情况下，其反应速率分别为多大？假定

16、 在上述情况下KI值均为310-4mol/L，则在上述两种抑制情况下的 抑制程度各有多大？,竞争性抑制：,非竞争性抑制：,1.4 复杂的酶反应动力学,1.4.1 可逆酶催化反应动力学,某木糖催化葡萄糖为果糖的反应至一定程度即达到平衡，其机理可认为是,由稳态及酶衡算得:,由稳态及酶衡算得:,1.4.2 双底物酶催化反应动力学,1.4.2.1 随机机制,两个底物S1和S2随机地与酶结合，产物P1和P2也随机地释放出来。,如,为常数，则,式中：,如,均为变量则:,1.4.2.2 顺序机制（大部分脱氢酶）,两个底物S1和S2与酶结合成复合物是有顺序的，酶先与底物 S1结合形成ES1复合物，然后该复合物

17、ES1再与S2结合形成具有催化活性的ES1S2。按同样推导方法求出下述方程式：,式中：KmS1为单底物时的米氏常数，mol/L;Kms1S2浓度饱和时，S1的米氏常数，mol/L;Kms2S1浓度饱和时，S2的米氏常数，mol/L;,1.4.2.3 乒乓机制,1.4.2.3 乒乓机制,S1、S2始终不同时与酶结合，其机理可表示为（E*为修改过的酶）：,变构酶又称为调节酶，它是一种寡聚酶。这类酶具有变构部位和活性部位。当底物分子与这类酶结合时，能诱导酶的结构改变，增加酶与底物的结合能力，表现出底物对酶的激活效应。变构酶的作用机理十分复杂。已提出的模型有渐变模型，同构模型等。对变构酶催化反应动力学

18、的描述通常采用的是Hill方程，可表示为：,1.4.3 变构酶催化反应动力学,底物分子与这类酶结合时能诱导酶的结构改变增加E与S的结合能力，表现出底物对酶的激活效应。,Hill经验公式：,有磷酸果糖激酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、苏氨酸脱氢酶等,底物分子与这类酶结合时能诱导酶的结构改变增加E与S的结合能力，表现出底物对酶的激活效应。,有磷酸果糖激酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、苏氨酸脱氢酶等,1.5 反应条件对酶反应速率的影响,内部因素：酶的结构特征，底物的结构特征。,外部因素：pH、T、P、离子强度、各种物质的浓度因素,1.5.1 pH值的影响,酶分子上有许多酸性和碱性的氨基酸侧链基团，如果酶要表示其活性

19、，则这些基团必须有一定的解离形式。,随着pH的变化，这些基团可处在不同的解离状态，而具有催化活性的离子基团仅是其中一种特定的解离形式，因而随着pH值的变化，具有催化活性的这种特殊的离子基团在总酶量中所占的比例就会不同，因而使酶所具有的催化能力也不同。,Michaelis对pH与酶活力的关系提出三状态模型的假设：,1.5.2 温度的影响,在适宜的温度内，酶催化反应速率常数中的k+2与温度的关系符合Arrhenius方程，即：,k+2=Aexp(-Ea/RT),k+2=ATexp(-H*/RT),根据Eryring的过渡态理论：,Ks=Aexp(-H/RT),1.5.3 酶的失活动力学,酶是一种不

20、稳定的物质，常因温度、pH等因素的影响而产生不可逆的活性下降。一般是胞外酶较稳定，而胞内酶在外部环境中容易失活。酶在保存和参与反应时均有可能失活，前者的失活又称为稳定性。在使用时酶的失活对于酶催化反应过程的设计和控制都是十分重要的。其中酶的热失活，或称热变性是最重要的一种酶失活形式。下面主要讨论此种失活动力学。,未反应时酶的热失活动力学,测定酶在未反应时的热稳定性方法：在一定条件下，使酶溶液恒温保持一定的时间，然后再在最 适宜的pH和温度下测定残存的酶活力，即残存酶活。,cEocEt+cD,对于可逆的：,对于不可逆的失活反应，kr=0，因此：,反应时酶的热失活动力学,酶在反应中的稳定性称为操作

21、稳定性。在酶催化反应时，由于底物和产物的存在，使酶的稳定性或者得到增强，或者又有所减弱。,1时，底物对酶失活没有影响,0时，酶完全被底物所保护，ES完全不失活，此时只有游离酶失活,01时，底物对酶有部分保护作用，能在一定程度上抑制酶的失活,1时，底物加速酶的失活,1.6 酶的界面催化反应动力学,1.6.1 液-固界面的酶催化反应动力学,酶在底物上的吸附平衡,当底物生成产物反应为CES的一级反应时，,1.6.2 液-液界面的酶催化反应动力学,总结,1.1酶反应的基本特征,简单介绍酶催化反应和普通化学催化反应的共同性。详细介绍酶的催化特性。,1.2 简单酶催化反应动力学,详细介绍简单酶催化反应模型

22、、平衡法、拟稳态法以及酶动力学参数的求取方法。,1.3 有抑制的酶催化反应动力学,详细介绍竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争抑制动力学的共性和特性，与无抑制动力学的关系。,1.4复杂的酶反应动力学,详细介绍可逆反应，双底物酶催化反应（包括随机机制、顺序机制和乒乓机制）简单介绍变构酶反应动力学。,1.5 反应条件对酶反应速率的影响,详细介绍pH和温度对酶催化的影响的机理、规律。,详细介绍未反应时酶的热失活动力学，简单介绍反应时酶的热失活动力学。,1.6 酶的界面催化反应动力学（了解）,本章作业,1、酶作为生物催化剂具有那些催化剂的共性和其独特的催化特性？谈谈酶反应专一性的机制。,2.什么是抑制百分数？它的物理含义是什么？抑制百分数是怎样判断反应的抑制类型？,3.谈谈影响酶催化反应速率的因素,书上作业：1，2，3，4，7，8，10，12,