《遗传信息的传递》PPT课件.ppt
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1、,第三节 RNA的生物合成,一、转录的酶学基础,转录:是在 DNA指导的RNA聚合酶的催化下,按照碱基配对的原则,以四种NTP为原料合成一条与模板DNA互补的RNA 的过程。,RNA的转录从DNA模板的特定位点开始,并在一定的位点终止。,1.模板,结构基因:DNA分子中能转录出RNA的区段。结构基因的双链中,仅有一股链作为模板转录成RNA,称为模板链,也称作无义链、Watson(W)链、负(-)链或反意义链。与模板链相对应的互补链,编码区的碱基序列与mRNA的密码序列相同(仅T、U互换),称为编码链,也称为有义链、Crick(C)链、正(+)链,或有意义链。,RNA聚合酶(RNA pol),也
2、称为转录酶、DNA指导的RNA聚合酶,能直接催化2个游离的NTP形成磷酸二酯键而引发转录的起始,不需要引物。1)原核生物的RNA聚合酶一种,能催化mRNA、tRNA和rRNA等的合成。,2.原料:4种核苷三磷酸(NTP,包括ATP、GTP、CTP和UTP),3.RNA聚合酶,全酶由5种亚基(2)及2个Zn原子组成。因子与其它部分的结合不是十分紧密,它易与2分离。没有亚基的酶称为核心酶只催化链的延长,对起始无作用。五种亚基的功能分别为:亚基:为二聚体,装配核心酶及识别启动子。亚基:含催化部位,起催化作用,催化形成磷酸二酯键。亚基:与DNA模板结合功能。亚基:识别起始位点。,大肠杆菌的RNA聚合酶
3、,大肠杆菌RNA聚合酶的结构示意图,核心酶(2),起始因子,装配核心酶及识别启动子催化聚合反应和模板DNA结合,全酶(),有关RNA聚合酶的几个知识点:只有全酶才能在正确位置起始转录。核心酶能在DNA模板上合成RNA,但不能在正确位置起始转录。因子仅能保证细菌RNA聚合酶稳定地结合到启动子上,它通常在RNA链合成89个碱基后释放。,2)真核生物的RNA聚合酶细胞核内,有三种:区别在于对-鹅膏蕈碱的敏感性不同。,此外,线粒体、叶绿体中也含有RNA聚合酶,其特性类似原核细胞中的RNA聚合酶,它们都是经过核基因编码、在细胞质中合成后再输送过去的。,RNApol:分子量约为500KDa,由1012个亚
4、基组成,有两个最大亚基,功能相当于细菌RNA聚合酶的亚基和亚基。大亚基(功能相当于细菌的亚基):有 C 末端结构域(carboxy terminal domain CTD)CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复 TyrSerProThrSerProSer C 端七肽重复序列 不同生物中重复次数不一样。,CTD中的 Ser和 Thr可被高度磷酸化 磷酸化的 RNApol 被称为A 非磷酸化的 RNApol 称为B CTD参与转录 B A 使 RNApol易于离开,启动子进入延伸过程。,二、原核生物转录机制,1.启动子(promoter):指RNA聚合酶特异识别的DNA序列,位于结构基因上游,长度从
5、100bp到200bp不等,本身不被转录。转录单位:在启动子与终止子之间的基因序列。起始点:指转录起始部位,即开始转录的第一个核苷酸,定为O点(以+1表示),由此向右称为下游,其核苷酸依次编为“正”号;起始点左侧称为上游,其核苷酸顺序向左依次编为“负”号,如紧接起始点左侧的核苷酸为-1。转录的第1个核苷酸常为嘌呤-G或A。,原核生物启动子,包括:识别部位(-35区):又称Sextama框,在-35处,高度保守,一致序列为5-TTGACA-3,是RNA聚合酶的因子对模板初始识别的部位。结合部位(-10区):又称Pribnow框,高度保守,一致序列为5-TATAAT-3,位于起始点上游-10处。因
6、Tm低,DNA易解开双链,是RNA聚合酶与DNA结合、起始复合物由关闭状态转变为启动状态的特定序列。CAP结合位点:在启动子上游,可能存在此位点。CAP(分解代谢物基因激活蛋白)是原核生物基因表达的一种正调节蛋白。,RNA polymeraese,RNA聚合酶(RNA polymerase);启动子(Promoter);转录起始点(startpoint);终止子(Terminator);上游(Upstream);下游(Downstream);近端(proximal);远端(distal),基因表达盒结构组成示意图,b.开放型启动子复合物的形成。RNApol的一个适合位点到达10序列区域,诱导富
7、含AT的Pribnow 框的“熔解”,形成1217bp的泡状物,同时酶分子向10序列转移并与之牢固结合。两种复合物均为二元复合物(全酶和DNA),1)起始:a.全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成。,2.转录过程,c.在开放型的启动子复合物中,将按照模板序列结合2个核苷酸,形成第一个磷酸二酯键(亚基)形成三元复合物(RNA/DNA/酶)。+1位多为CAT模式,位于离开保守T 69 个核苷酸处,d.因子解离 核心酶与DNA的亲和力下降 起始过程结束核心酶移动进入延伸过程,转录的起始过程示意图,核心酶,1217bp,2)延伸转录泡:是由DNA双链,RNA聚合酶与新合成的转录本RNA局部形成的
8、结构,它贯穿于延长过程的始终。过程:在起始阶段形成新生RNA短链后,因子脱离,RNA聚合酶的核心酶沿模板向下游移动,核苷酸之间以3,5-磷酸二酯键相连,合成方向为53,合成的RNA自3末端逐步延长。,拓扑学问题:RNA合成过程中,转录泡两端要发生拓扑转变。RNApol 的前沿.解螺旋作用 RNApol 后端.DNA的螺旋化 超缠问题的解决靠DNA旋转酶(拓扑异构酶II)RNA-DNA杂交链也要求作旋转运动,RNA链的延伸图解,3)终止:合成移到终止信号时,酶不滑动,聚合停止,转录完成。,提供转录停止信号的DNA序列称为终止子。终止子结构特点:为回文结构(反向重复序列),富含GC对,GC对下游为
9、6-8个AT对。协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子(蛋白质)则称为终止因子(termination factor),如:因子。,原核生物转录终止的机制:两种不依赖因子的终止子(强终止子):GC区形成的发卡结构阻碍RNA聚合酶的行进,聚U区使配对不稳定,以利于 RNA产物的释放。依赖因子的终止子(弱终止子):因子与RNA产物中富含C的部位结合,并诱使RNA聚合酶构象改变停止滑动;因子的解螺旋酶活性,利于RNA产物的释放。,不依赖 因子的终止子 结构特征:一是形成一个发夹结构(茎环结构)茎:720 bp的反向重复(inverted repeat,IR)序列形成(富含G/C)环:中间不重复序列形
10、成二是具有6 8 个连续的U串(发夹结构末端),E.coli trp 操纵子终止位不依赖因子的终止,茎部富含GC,依赖 因子的终止子结构 IR序列中的 GC 对含量较少。发夹结构末端没有固定特征。靠与因子的共同作用而实现终止,无连续 U串,G/C含量较少,依赖 因子的终止子终止转录的特点:通读(read through):在依赖 因子的转录终止 过程中,RNApol 转录了 IR 序列之后,虽发生一定时间的延宕,但如果没有 因子存在,则RNApol 会继续转录。因子 a、活性形式为六聚体 促进转录终止的活性,NTPase 活性。,b、RNA长度大于50nt时,依赖RNA的NTPase活性最大
11、说明:因子识别和结合的是RNA因子对终止子的作用 a、因子与RNA结合(终止子上游的某一处,RNA 的5端)。,b、因子沿RNA从53移动(NTP水解供能)。(终止子处的较长时间的延宕给因子追赶的机会),c、因子与 RNApol 相互作用而造成转录的终止。,终止反应还需要 RNA 与 DNA 的相互作用 即:需要一定的RNA序列 因为:其与模板的结合力必须弱到一定数值,才能配合因子与 RNApol 的作用(发夹结构下游的AU序列)序列不同的终止子不同的终止程度基因表达调控的途径之一。,结合上来追赶RNApol,追赶上来(暂停),与RNApol相互作用使杂交链解链,RNA合成过程,起始,双链DN
12、A局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子,终止子(terminator),3.原核生物前体mRNA的加工,原核生物mRNA大多是多顺反子,少数为单顺反子。由于原核细胞没有核膜,转录与翻译偶联,不存在加工过程。但也有少数多顺反子mRNA需要加工,需要切成小单位后再进行翻译。如教材P37,此外,在rRNA和tRNA基因中也存在类似的加工过程。如原核生物中rRNA前体的加工:首先生成的是30S前体rRNA,经甲基化和核酸酶切割,逐步裂解为16S、23S、5S 的rRNA和tRNA。,原核细胞mRNA的结构特点,5,3,先导区,AGGAGGU,SD区,顺反子(
13、cistron):指编码一种蛋白质的DNA单位。,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,原核生物中rRNA前体的加工,甲基化作用专一核酸外切酶,30S前体,17S,tRNA,25S,专一核酸外切酶,16S rRNA,tRNA,23S rRNA,5S rRNA,专一核酸外切酶,(1)双链DNA分子以单链为模板;(2)不需引物;(3)底物是5-核苷三磷酸(NTP);(4)前一个碱基的 3-OH和后一个碱基的 5-P反应,形成磷酸二酯键,RNA链延伸;(5)RNA碱基顺序由模板DNA顺序决定;(6)RNA合成方向是从53,新生RNA与模板DNA链呈反向平行;,
14、小结:RNA酶促合成的基本特征,三、真核生物转录机制,原核生物与真核生物mRNA的特征比较,结构特征 转录翻译发生的区域化部位 生命周期,原核生物mRNA:(1)许多以多顺反子形式存在;(2)5端无帽子结构;(3)3端没有或只有较短的poly(A)。,结构特征,转录始于核苷三磷酸(经常是A或G)。初始序列:5pppA/GpNpNpNp加工后:GpppA/GpNpNpNpNp 5 5 5-5Gppp+pppGpNpNp GpppGpNpNp+PP+P,(2)真核生物mRNA的5端存在“帽子”结构,真核生物mRNA结构特征:,(1)许多是以单顺反子形式存在;,鸟苷酰转移酶,帽子结构,高等真核生物(
15、不包括酵母)的mRNA的共同特征:poly(A)添加位点上游11-30个核苷酸区域内存在高度保守的AAAAAA序列。,(3)绝大部分真核生物 mRNA 3端含poly(A)尾巴,真核细胞mRNA的结构特点,m7G5ppp5Np-,帽子结构功能使mRNA免遭核酸酶的破坏使mRNA能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质被蛋白质合成的起始因子所识别,从而促进蛋白质的合成。,Poly(A)尾巴的功能是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性与翻译起始有关,AAAAAAA-OH,(4)真核生物mRNA中常含有内含子,Eukaryotic mRNA is modified
16、,processed,and transported,原核生物mRNA与真核生物mRNA结构比较,核糖体可以不从mRNA上解离连续合成三个蛋白质,转录翻译发生的区域化部位,细菌mRNA:转录和翻译发生在单一细胞区域化部位;其转录、翻译、降解间隔时间很短或同时进行。真核生物mRNA:合成与成熟完全在细胞核内发生,而翻译在细胞质中完成;其转录、翻译、降解三者间间隔时间较长。,Eukaryotic mRNA is modified and exported,生命周期,原核生物mRNA寿命较短,通常只能翻译几分钟;真核生物mRNA寿命较长,可持续翻译几小时。,真核生物和原核生物转录机制的差别,DNA,
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